徐建妙，趙哲，陳策，柳志強(qiáng)

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 浙江 杭州，310014)

L-2-氨基丁酸(L-2-aminobutyric acid,L-ABA)可通過(guò)酰胺化制備(S)-2-氨基丁酰胺鹽，是合成抗癲癇藥左乙拉西坦的關(guān)鍵中間體，也可通過(guò)還原末端羧基用于制備(S)-2-氨基丁醇，并被用來(lái)合成乙胺丁醇[1-2]。目前，L-2-氨基丁酸的合成主要由化學(xué)法合成和生物法合成?；瘜W(xué)法合成常需要昂貴的試劑，成本較高，工業(yè)生產(chǎn)不易采用，同時(shí)大量有機(jī)溶劑的使用還會(huì)造成環(huán)境污染[3-4]。生物法包括微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法，酶轉(zhuǎn)化法是一種高選擇性反應(yīng)，不同種類的酶可作用于不同構(gòu)型和不同種類的特定底物，從而達(dá)到定向轉(zhuǎn)化的目的。目前酶法制備L-2-氨基丁酸主要有兩種，一種是對(duì)消旋 2-氨基丁酸進(jìn)行酶法拆分制備[5]；另一種是以 2-酮丁酸為原料，通過(guò)脫氫酶[6-8]或者轉(zhuǎn)氨酶[9-15]來(lái)催化制備。但是由于2-酮丁酸價(jià)格較高，直接以其為原料不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。目前，比較常用的是用蘇氨酸脫氨酶(TD)催化價(jià)格相對(duì)低廉的L-蘇氨酸為2-酮丁酸，同時(shí)添加亮氨酸脫氫酶(LDH)在外加NAD+或NADH的基礎(chǔ)上，以甲酸脫氫酶(FDH)催化甲酸銨用于輔酶NADH的循環(huán)再生(圖1)。

圖1 蘇氨酸脫氨酶、亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶偶聯(lián)催化合成L-2-氨基丁酸工藝路線Fig.1 Synthesis of L-2-ABA by coupling TD, LDH and FDH

相對(duì)于其他NADH輔酶再生體系，甲酸銨/甲酸脫氫酶用于NADH輔酶再生體系優(yōu)勢(shì)明顯。例如，其反應(yīng)具有不可逆性，所產(chǎn)生的副產(chǎn)物CO2對(duì)反應(yīng)體系無(wú)任何不良影響，也易于后期產(chǎn)品的分離提取[16]。但是，目前報(bào)道的不同種類來(lái)源的甲酸脫氫酶催化活力普遍較低，蛋白表達(dá)的可溶性偏低，底物的轉(zhuǎn)化率不高，不利于后期工業(yè)化應(yīng)用。本論文主要是對(duì)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的重組菌表達(dá)甲酸脫氫酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，用于后續(xù)的催化反應(yīng)，并對(duì)催化反應(yīng)工藝進(jìn)行探索，以尋找一條底物轉(zhuǎn)化率高，成本低廉并能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)路徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-蘇氨酸(L-Thr)，甲酸銨，阿拉丁公司；NAD+, 上海生工。重組大腸桿菌Escherichiacoli-BL21(DE3)/pET28b-FDH (FDH的基因片段來(lái)自Fusariumgraminearum)，由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，Eclipse XD8-C18(5 μm 4.6 mm×250 mm)，美國(guó)戴安公司；恒溫水浴鍋，上海一恒科技；低溫離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter公司；ME104E型電子天平，Mettler-Toledo儀器有限公司。5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社。多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices；全自動(dòng)旋光儀，美國(guó)魯?shù)婪蚬尽?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15 g/L、酵母粉 10 g/L、NaCl 10 g/L、甘油 12 g/L、(NH4)2SO45 g/L 、KHPO41.36 g/L、K2H2PO4·3H2O 2.28 g/L、MgSO4·7H2O 0.375 g/L，在 121 ℃滅菌 20 min，接種時(shí)添加無(wú)菌的卡那霉素。

種子培養(yǎng): 從甘油管中吸取50 μL菌液接入裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基的搖瓶，并加入50 μL質(zhì)量濃度 50 mg/L卡那霉素，37 ℃，150 r/min恒溫培養(yǎng)12 h。

搖瓶培養(yǎng)及誘導(dǎo)：培養(yǎng)基用LB培養(yǎng)基，種子液以1%(v/v)的接種量及100 μL質(zhì)量濃度為50 mg/L的卡那霉素轉(zhuǎn)接至100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，180 r/min的搖床上培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG, 降溫誘導(dǎo)培養(yǎng)。結(jié)束后，于8 000 r/min，4 ℃，離心10 min收集菌體，將菌體于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo): 培養(yǎng)基用發(fā)酵培養(yǎng)基，將種子液按 5%接種量接種并添加卡那霉素于發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 7.0，控溫37 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速450 r/min ，待OD600值為8時(shí)降溫至22 ℃，加入合適濃度的誘導(dǎo)劑乳糖，繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心15 min，收集菌體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 分析方法

衍生化條件：50 μL 1% 2,4-二硝基氟苯乙腈溶液、100 μL待測(cè)樣品以及100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液，60 ℃避光反應(yīng)60 min，進(jìn)樣檢測(cè)。色譜條件：液相柱 Eclipse XD8-C18(5 μm 4.6 mm×250 mm) ，流動(dòng)相：0.02 mol/L的磷酸氫二鈉(pH=7.2)∶乙腈=70∶30，流速：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm。原理：在堿性條件下，氨基酸的游離末端NH2與2,4-二硝基氟苯發(fā)生親核芳環(huán)取代反應(yīng)后，生成黃色的二硝基苯氨基酸衍生物，可用HPLC進(jìn)行定量測(cè)定。

菌體密度測(cè)定：菌體密度以O(shè)D600表示，將發(fā)酵液稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)于600 nm處測(cè)定吸光值。菌體破碎液的制備: 發(fā)酵所得菌體用 0.1 mol/L、pH 8.5磷酸鹽緩沖液懸浮，置于超聲破碎儀中破碎。超聲破碎條件：工作功率300 W，工作 1 s，間歇 1 s，破碎時(shí)間20 min。破碎液于 4 ℃，8 000 r/min離心 15 min，取上清液經(jīng)Ni柱純化后用于酶蛋白含量及酶活測(cè)定。蛋白含量測(cè)定選用凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒。酶活測(cè)定用96孔板檢測(cè)NADH吸光值(340 nm對(duì)應(yīng)的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線作為參照)。1 U酶活定義為pH 7.5，35 ℃下每分鐘催化生成1 μmoL NADH所需的酶量。1 L催化反應(yīng)體系控制攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min,恒溫35 ℃，開(kāi)始時(shí)投加120 g的L-蘇氨酸和120 g的甲酸銨，0.03 g NAD+，3 h添加30 g蘇氨酸和0.02 g NAD+，反應(yīng)6 h添加30 g蘇氨酸和0.03 g NAD+，反應(yīng)8 h在反應(yīng)中添加0.02 g NAD+。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶水平對(duì)重組菌表達(dá)甲酸脫氫酶蛋白的優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度的確定

設(shè)置16、18、20、22、24、26和28 ℃這7個(gè)溫度梯度，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，IPTG濃度0.1 mmol/L。由圖2可以看出，溫度對(duì)外源蛋白的表達(dá)影響較大，當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃時(shí)，表達(dá)的蛋白基本可溶，隨著誘導(dǎo)溫度的逐漸升高，包涵體也逐漸增多，當(dāng)誘導(dǎo)溫度超過(guò)24 ℃時(shí)，沉淀中的蛋白含量超過(guò)了上清液中的。

A～G-分別是在誘導(dǎo)溫度16、18、20、22、24、26和28 ℃下培養(yǎng) E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物；a～g為相對(duì)應(yīng)的沉淀物圖2 不同誘導(dǎo)溫度下FDH的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of FDH at different induced temperatures

隨著溫度的升高，細(xì)胞破碎液上清中的蛋白濃度略有下降，但是沉淀中的蛋白隨著溫度的升高，明顯增加，這也說(shuō)明隨著溫度的升高，大部分蛋白都沒(méi)有得到正確折疊，從而形成了包涵體。取等量的7組菌體破碎液與蘇氨酸脫氨酶及亮氨酸脫氫酶粗酶液匹配，外加輔酶NAD+，底物L(fēng)-蘇氨酸，輔底物甲酸銨。圖3顯示，隨著誘導(dǎo)溫度的降低，外源表達(dá)的甲酸脫氫酶對(duì)于催化反應(yīng)進(jìn)程有促進(jìn)。綜合考慮選用22 ℃作為后期誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的合適溫度。

圖3 不同誘導(dǎo)溫度下表達(dá)的甲酸脫氫酶對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的影響Fig.3 Time course of production of L-ABA by FDH using different induced temperatures

2.1.2 IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

確定誘導(dǎo)溫度為22 ℃，設(shè)置0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，從圖4的蛋白膠圖可以看出，添加0.01 mmol/L的 IPTG后目的蛋白的表達(dá)量相對(duì)于其他幾組的蛋白表達(dá)量較少。隨著誘導(dǎo)劑濃度的提高，蛋白表達(dá)并沒(méi)有明顯提高。圖5的結(jié)果也顯示，采用0.01 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)的菌體用于催化反應(yīng)，底物轉(zhuǎn)化率只有70%，但是過(guò)高的濃度也不會(huì)有效促進(jìn)催化反應(yīng)的進(jìn)程。綜合考慮選用0.1 mmol/L IPTG作為后期誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑。

A～F-分別是在誘導(dǎo)劑濃度0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mmol/L下培養(yǎng)E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物； a～f-相對(duì)應(yīng)的沉淀物圖4 不同誘導(dǎo)劑濃度下FDH的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.4 SDS-PAGE analysis of FDH at different inducer concentrations

圖5 不同濃度IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)的甲酸脫氫酶對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程影響Fig.5 Time course of production of L-ABA by FDH using different IPTG concentration

2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間的確定

確定誘導(dǎo)溫度22 ℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.1 mmol/L ，設(shè)置誘導(dǎo)時(shí)間8、10、12、14、16、18和20 h。圖6表明隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的表達(dá)量也隨著增加。然而，包涵體也隨之增多。圖7隨著目的蛋白誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，一定程度上利于催化反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間大于16 h，其催化反應(yīng)進(jìn)程不會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯變化。綜合考慮選用16 h誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)作為后期誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的時(shí)間。

A～G-分別是在誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)8、10、12、14、16、18和20 h下培養(yǎng) E. coli BL21-FDH 的菌體破碎上清物；a～f-相對(duì)應(yīng)的沉淀物圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間下FDH的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.6 SDS-PAGE analysis of FDH in different induction time

圖7 不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)的甲酸脫氫酶對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的影響Fig.7 Time course of L-ABA production by FDH at different induction time

經(jīng)搖瓶水平優(yōu)化后甲酸脫氫酶的酶活為7.16 U/mg，相對(duì)于原始菌株搖瓶培養(yǎng)蛋白酶活6.88 U/mg并沒(méi)有顯著提高，然而可溶性目的蛋白表達(dá)量為52.12 mg/g，相對(duì)于原始菌株搖瓶培養(yǎng)蛋白表達(dá)量40.12 mg/g提高29.91%(圖8)。

1-原始菌株;2-搖瓶?jī)?yōu)化圖8 純化后的甲酸脫氫酶SDS-PAGE結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE analysis of purified FDH

2.2 5 L發(fā)酵罐水平對(duì)重組菌表達(dá)甲酸脫氫酶蛋白的優(yōu)化

2.2.1 不同乳糖濃度誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的甲酸脫氫酶對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的影響

用質(zhì)量濃度分別為5、8、10、12.5、15、18 g/L的乳糖誘導(dǎo)外源甲酸脫氫酶蛋白的表達(dá)。由圖9可以看出，5 g/L的乳糖添加，8 h目的酶蛋白催化底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)到88%左右，18 h催化底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)到95%左右。隨著乳糖質(zhì)量濃度增加，前期催化底物能力略有下降，后期皆能使底物完全轉(zhuǎn)化。故選用乳糖質(zhì)量濃度為8 g/L。

圖9 不同乳糖濃度誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的甲酸脫氫酶對(duì)催化活力影響Fig.9 Effect of lactose on FDH catalysis activity

2.2.2 不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的甲酸脫氫酶對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程影響

一般而言，外源蛋白在重組菌中會(huì)隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白的表達(dá)量會(huì)有一定程度的增加。在5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體過(guò)程中，分別在誘導(dǎo)后8、10、12、14、16、18、20 h取樣檢測(cè)。由圖10可以看出隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，目的酶蛋白的催化能力也隨著增加，16 h后基本趨于穩(wěn)定。故選用誘導(dǎo)時(shí)間16 h。

圖10 不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的甲酸脫氫酶對(duì)催化活力的影響Fig.10 Effect of induction time on FDH catalysis activity

在5 L發(fā)酵罐水平上對(duì)外源甲酸脫氫酶蛋白發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化(見(jiàn)圖11)。結(jié)果表明，目的蛋白在誘導(dǎo)溫度22 ℃,誘導(dǎo)劑乳糖質(zhì)量濃度8 g/L,誘導(dǎo)16 h下可溶性目的蛋白表達(dá)量為41.26 mg/g，相對(duì)于原始菌株發(fā)酵罐培養(yǎng)蛋白表達(dá)量為34.15 mg/g，提高20.82%。甲酸脫氫酶優(yōu)化后的酶活為6.12 U/mg，相比于原始菌株發(fā)酵培養(yǎng)得到目的蛋白酶活5.88 U/mg略有提高。

1-原始菌株;2-發(fā)酵罐優(yōu)化圖11 純化后的甲酸脫氫酶SDS-PAGE結(jié)果Fig.11 SDS-PAGE analysis of purified FDH

圖12 三酶偶聯(lián)催化合成L-2-氨基丁酸進(jìn)程Fig.12 Time course of production of L-ABA by FDH coupling with TD and LDH

圖12表明，在1 L反應(yīng)體系中，利用優(yōu)化后的甲酸脫氫酶，耦合蘇氨酸脫氨酶和亮氨酸脫氫酶，底物L(fēng)-蘇氨酸180 g，在9 h完全被轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基丁酸，轉(zhuǎn)化率99%以上，e.e.值99.5%以上，時(shí)空產(chǎn)率17.2 g/(L·h)。

3 結(jié)論

本文分別在搖瓶及5 L發(fā)酵罐水平對(duì)重組甲酸脫氫酶工程菌的外源表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明:當(dāng)誘導(dǎo)溫度為22 ℃，IPTG濃度為0.1 mmol/L(搖瓶培養(yǎng))、乳糖質(zhì)量濃度8 g/L(發(fā)酵罐培養(yǎng))，誘導(dǎo)時(shí)間16 h時(shí)，有利于甲酸脫氫酶的外源表達(dá)。在5 L發(fā)酵罐水平目的蛋白由34.15 mg/g提高到41.26 mg/g，酶活由5.88 U/mg提高到6.12 U/mg。從研究結(jié)果可以看出，溫度是影響目的蛋白的可溶表達(dá)的最大因素，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量具有比較顯著的影響，相對(duì)而言誘導(dǎo)劑的濃度對(duì)目的蛋白的影響并不顯著。利用5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得的菌體經(jīng)破碎獲得的甲酸脫氫酶粗酶液匹配蘇氨酸脫氨酶粗酶液，亮氨酸脫氫酶粗酶液，在1 L反應(yīng)體系中外加NAD+0.1 g, 底物L(fēng)-蘇氨酸180 g，輔底物甲酸銨120 g，輔酶NAD及底物L(fēng)-蘇氨酸分別采用分批添加策略，9 h左右底物L(fēng)-蘇氨酸幾乎完全轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-2-氨基丁酸。相比于一次性添加底物L(fēng)-蘇氨酸及輔酶NAD+而言催化反應(yīng)進(jìn)程明顯縮短，底物催化濃度明顯提高，底物轉(zhuǎn)化率99%以上，時(shí)空產(chǎn)率17.2 g/(L·h)，e.e.值99.5%以上。反應(yīng)底物濃度及時(shí)空得率均高于目前報(bào)道水平。本課題所采用的生產(chǎn)工藝及結(jié)果為后續(xù)L-2-氨基丁酸的工業(yè)化提供一定的參考依據(jù)。