劉嘉男,鞏建業(yè),高庭,李利君,倪輝

(集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門，361021)

異槲皮苷是一種含有多個(gè)酚羥基的黃酮醇苷類化合物，具有消除炎癥[1]、抗氧化活性[2]、降血糖[3]、降血壓[4]、抗過敏[5]等藥理作用。異槲皮苷的天然含量很少，往往通過水解蘆丁來制備。常用的方法有強(qiáng)酸水解蘆丁、有機(jī)溶劑提取、高壓水解蘆丁和酶水解蘆丁等[6-8]。其中強(qiáng)酸和有機(jī)溶劑提取法對(duì)環(huán)境的污染嚴(yán)重，高壓水解法對(duì)生產(chǎn)設(shè)備耐高溫高壓要求高、耗能較大，而利用酶水解蘆丁操作工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和且污染較少，具有重要研究應(yīng)用價(jià)值。

α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)可用于制備異槲皮苷，通過水解蘆丁上的1,6-α-鼠李糖苷鍵，生成異槲皮苷。吳迪[9]等人研究表明，運(yùn)用蘆丁-L-鼠李糖苷酶轉(zhuǎn)化蘆丁生產(chǎn)異槲皮苷，生產(chǎn)反應(yīng)的條件溫和、易于控制，是制備異槲皮苷的理想方法，因此研究相關(guān)酶的發(fā)酵生產(chǎn)具有重要意義。張雪銘[10]等人研究了黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶高密度發(fā)酵條件，取得了一定成果。但黑曲霉發(fā)酵后需要通過純化去除自身產(chǎn)生的其他多種蛋白，同時(shí)黑曲霉常見的固態(tài)發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生菌絲體，為純化帶來不便[11]。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有表達(dá)效率高，自身分泌蛋白少[12-13]，胞外表達(dá)的目的蛋白易于純化等特點(diǎn)[14]；此外，畢赤酵母成熟的發(fā)酵工藝適用于高密度發(fā)酵，可滿足α-L-鼠李糖苷酶的工業(yè)實(shí)際應(yīng)用。研究發(fā)酵過程中甲醇的添加量是保證畢赤酵母不受甲醇毒害作用，保持正常分泌外源蛋白的重要因素[15]。α-L-鼠李糖苷酶的固定化能簡(jiǎn)化酶在反應(yīng)體系中的分離工藝，提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，節(jié)約成本同時(shí)簡(jiǎn)化催化工藝，提高生產(chǎn)效率[16]。因此，本研究通過優(yōu)化甲醇的添加量提高了α-L-鼠李糖苷酶高密度發(fā)酵產(chǎn)量，并對(duì)該酶的固定化特性進(jìn)行了研究，為工業(yè)化生產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶和酶法轉(zhuǎn)化蘆丁生產(chǎn)異槲皮苷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株，由集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏。蘆丁(≥98%)購(gòu)于西安小草植物科技有限責(zé)任公司；甲醇(GR)、乙腈(GR)購(gòu)于美國(guó)西格瑪奧德里奇有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BLBIO-5SJ 發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；DGU/SPD/SIL-20A高效液相色譜儀，日本島津儀器制造有限公司；ALP全自動(dòng)滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；ZD-9550脫色搖床，海門其林貝爾儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶5 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

以3.325 g無氨基酵母氮源、3.725 mL甘油、0.1 mg生物素和250 mL無菌水配置成種子培養(yǎng)基接入1 mL重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha菌株，于30 ℃、200 r/min的搖床中培養(yǎng)至有白色結(jié)晶出現(xiàn)，然后以5%的接種量接種到2.5 L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以體積分?jǐn)?shù)為25%的NH4OH調(diào)節(jié)pH至5.0～6.0，在30 ℃及溶解氧高于40%的條件下發(fā)酵培養(yǎng)。

待培養(yǎng)基中的甘油耗盡后，進(jìn)行流加甘油培養(yǎng)，初始流加速率為10 mL/(L·h)，經(jīng)過10 h后，將流速提升到500 mL/(L·h)，培養(yǎng)酵母直至所需密度。發(fā)酵過程中每隔8 h取1次樣測(cè)濕重及酶活。

甘油流加培養(yǎng)至所需密度后，停止補(bǔ)加甘油，將溶解氧調(diào)節(jié)至60%左右維持30 min，隨后將發(fā)酵溫度調(diào)節(jié)至28 ℃，pH值調(diào)節(jié)至pH 5.0繼續(xù)發(fā)酵并開始流加甲醇。甲醇的流加速度最初2 h為3 mL/(L·h)，之后每隔1 h增加1 mL/(L·h)。當(dāng)流速為6 mL/(L·h)后，維持3～4 h。之后以發(fā)酵液2.5 L體積分?jǐn)?shù)的0.17%、0.5%、1%每隔1 h補(bǔ)加甲醇，每隔8 h取1次樣測(cè)酶活。經(jīng)過3 d甲醇誘導(dǎo)后，獲得發(fā)酵酶液。

1.3.2 生物量和酶活的測(cè)量

取1 mL的發(fā)酵液于1.5 mL的離心管中， 8 000 r/min離心2 min，倒掉上清液，洗滌烘干后稱量得到菌體的干重[17]。

酶活測(cè)量采用高效液相色譜(HPLC)法[18]：量取1.0 mL質(zhì)量濃度為300 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10 mL的離心管中，再加入980 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)，漩渦混勻，置于60 ℃ 水浴鍋中保溫10 min，迅速加入20 μL酶溶液，混勻，在60 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min后立即放入沸水中滅活12 min，冷卻后過0.22 μm濾膜，空白對(duì)照組以滅活的酶液代替原酶溶液，其余步驟同上。然后利用高效液相色譜儀檢測(cè)蘆丁含量并依此計(jì)算酶活。使用Symmetry C18反相柱，柱溫為35 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣體積20 μL，流速0.25 mL/min，走樣時(shí)間60 min，流動(dòng)相為A： 0.5%甲酸水溶液，B:乙腈，經(jīng)優(yōu)化得出的梯度洗脫條件如表1所示。

表1 液相洗脫條件Table 1 Liquid phase elution conditions

α-L-鼠李糖苷酶酶活力單位的定義(U)：以每分鐘消耗1 μmol蘆丁所需要的酶液量定義為1個(gè)α-L-鼠李糖苷酶活力單位。

1.4 固定化酶凝膠顆粒的制備

稱取0.1 g海藻酸鈉和2.4 g聚乙烯醇加入34 mL無菌水加熱溶解，冷卻后加入0.5 mL的戊二醛靜置1 h，在交聯(lián)后的溶液中滴加質(zhì)量濃度為9.3 mg/mL的酶液6 mL，放在恒溫振動(dòng)器(22 ℃,150 r/min)振動(dòng)，2 h后加入1.6 g硼酸和0.4 g CaCl2攪拌造粒，15 min后放入質(zhì)量濃度為10%的Na2SO4中4 h,進(jìn)行固定化，得到固定化酶凝膠顆粒儲(chǔ)存在pH 4.0的醋酸緩沖液中于4 ℃保存。

1.5 固定化α-L-鼠李糖苷酶性質(zhì)測(cè)定

1.5.1 固定化α-L-鼠李糖苷酶酶活測(cè)定

酶活力測(cè)定的反應(yīng)體系：0.98 mL檸檬酸緩沖液(20 mmol/L，pH 4.0)與1 mL質(zhì)量濃度為300 μg/mL蘆丁底物混合，置于50 ℃條件下溫育10 min后，加入1 g固定化酶液混勻，于50 ℃反應(yīng)15 min后，立即取出固定化酶，將體系置于100 ℃沸水浴10 min，冷卻至室溫，過0.22 μm水膜后用液相色譜測(cè)定蘆丁含量的變化?？瞻追磻?yīng)是將加入的酶液換為100 ℃沸水滅活的酶。

1.5.2 固定化α-L-鼠李糖苷酶最適溫度測(cè)定

最適溫度：按一定比例將固定化酶加入到pH值為4的檸檬酸鹽緩沖液中混勻，分別在30、35、40、45、50、55、和60 ℃的酶反應(yīng)體系下反應(yīng)15 min，測(cè)定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，以酶活力最高的為100%，空白組以100 ℃滅活的酶液進(jìn)行同樣條件的酶反應(yīng)。

1.5.3 固定化α-L-鼠李糖苷酶最適pH測(cè)定

最適pH：按一定比例將固定化酶加入到不同pH(2.0～6.0)的50 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液中，在50 ℃測(cè)定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，以酶活力最高的為100%，空白組以100 ℃滅活的酶液進(jìn)行同樣條件的酶反應(yīng)。

1.5.4 固定化α-L-鼠李糖苷酶底物動(dòng)力學(xué)

以不同質(zhì)量濃度的(12.5、25.0、50.0、100.0、150.0和200.0 μg/mL)蘆丁為底物，在最適pH和最適溫度的條件下，測(cè)定α-L-鼠李糖苷酶酶活力，按照Lineweaver-Burk plots雙倒數(shù)曲線作圖法計(jì)算重組酶對(duì)柚皮苷的米氏常數(shù)(Km)。

1.5.5 固定化α-L-鼠李糖苷酶操作半衰期及穩(wěn)定性

將固定化酶置于pH為4的檸檬酸鹽緩沖液中50 ℃溫浴，每隔1 h取適量固定化酶依酶活反應(yīng)體系測(cè)定酶活，以初始酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。

取適量固定化顆粒，在最適pH和最適溫度的條件下按照酶活反應(yīng)體系連續(xù)進(jìn)行6批次操作，以最高酶活力作為100%計(jì)算相對(duì)酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-L-鼠李糖苷酶發(fā)酵結(jié)果

α-L-鼠李糖苷酶發(fā)酵結(jié)果如圖1所示。在5 L發(fā)酵罐中，當(dāng)罐內(nèi)溶氧量上升時(shí)，控制甲醇加入，體積分?jǐn)?shù)分別為0.17%、0.5%和1%時(shí)，重組畢赤酵母GS115/pPIC9k-rha的酶活和生物量都呈現(xiàn)出隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的趨勢(shì)，誘導(dǎo)發(fā)酵到最后的酶活分別為1 865.8、2 766.0和1 979.9 U/mL，生物量能達(dá)到209、228和194 g/L。甲醇在畢赤酵母發(fā)酵過程中既是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的碳源又是菌體的能源物質(zhì)，添加量過少，則菌體沒有足夠的能源用于分泌外源蛋白，故而酶活有所降低；而甲醇添加量如果過高，又會(huì)產(chǎn)生毒害作用，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)甚至引起細(xì)胞死亡，同樣會(huì)影響酶活結(jié)果。所以發(fā)酵過程中最適甲醇添加量為發(fā)酵液總體積的0.5%。與搖瓶發(fā)酵最適條件相比，發(fā)酵罐發(fā)酵后的酶活是搖瓶的3.89倍[19]。

A-不同甲醇添加量對(duì)酶活力的影響；B-不同甲醇添加量對(duì)生物量的影響圖1 不同甲醇添加量下酶活與生物量結(jié)果Fig.1 Enzyme activity and biomass results of different methanol additives

采用SDS-PAGE鑒定重組α-L-鼠李糖苷酶，得到結(jié)果如圖2，泳道中可見一單一條帶，分子質(zhì)量約100 kDa，與原始黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶大小相似。整體來看發(fā)酵上清中目的蛋白純度高，雜蛋白含量較低，可直接對(duì)發(fā)酵上清液進(jìn)行固定化操作。

圖2 重組α-L-鼠李糖苷酶SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE of recombinant α-L-rhamnosidase

2.2 固定化酶的制備

采用海藻酸鈉聚乙烯醇制備固定化酶凝膠顆粒時(shí)，聚乙烯醇有利于增強(qiáng)凝膠的耐久性和機(jī)械強(qiáng)度，海藻酸鈉能形成黏稠均勻溶液，可以改善凝膠的表面性質(zhì)，減少聚集的可能[20]。最終制成的成品如圖3，固定化α-L-鼠李糖苷酶珠子大小均勻，彈性好，圓潤(rùn)光滑，具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，酶活為20 U/g，酶活回收率為32.88%。

圖3 制備的固定化α-L-鼠李糖苷酶Fig.3 The picture of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3 固定化α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 固定化酶最適溫度

在酶促反應(yīng)體系溫度30～60 ℃，pH 4.0的條件下測(cè)定酶活力，確定固定化α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度。由圖4可知，固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活力隨著溫度上升呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)。固定化酶的最適溫度為50 ℃。而由前期實(shí)驗(yàn)得知游離酶的最適溫度為60 ℃。因?yàn)楣潭ɑd體聚乙烯醇和海藻酸鈉熔點(diǎn)較低，在溫度高于50 ℃后固定化酶的膠質(zhì)開始融化[21]，受此因素影響使得該方法制備的固定化酶的耐熱性較差。但固定化的α-L-鼠李糖苷酶在35～50 ℃之間維持了較高的催化活性，與游離酶相差不大。

圖4 溫度對(duì)固定化α-L-鼠李糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of different temperature on residual activity of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.2 固定化酶最適pH

在溫度為50 ℃的條件下，酶促反應(yīng)體系的pH分別為2、3、4、5、6時(shí)測(cè)定固定化α-L-鼠李糖苷酶酶活。在pH為2時(shí)海藻酸鈉降解明顯，不能形成凝膠顆粒，所以該固定化酶的起始測(cè)定pH值為3。固定化酶最適pH的結(jié)果如圖5所示，固定化α-L-鼠李糖苷酶的最適pH范圍在3.0～4.0，與游離酶的最適pH相同。隨著pH的繼續(xù)升高，酶活迅速降低，說明該固定化酶是在酸性環(huán)境中催化性能較好。

圖5 不同pH對(duì)固定化α-L-鼠李糖苷酶活力的影響Fig.5 Effect of different pH on residual activity of immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.3 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定分析

在60 ℃下，在pH為4.0的條件下以不同濃度的蘆丁作為底物，測(cè)定固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活并計(jì)算其反應(yīng)初速率，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/[V]為縱坐標(biāo)制作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)的擬合曲線，得到動(dòng)力學(xué)結(jié)果如圖6，Lineweaver-Burk雙倒數(shù)的擬合方程為y=0.449 4x+0.000 16，R2=0.97。計(jì)算固定化酶酶解反應(yīng)的米氏常數(shù)Km為0.47 mmol/L，而前期實(shí)驗(yàn)得知游離酶的Km為0.25 mmol/L，酶固定化后的Km值相較于游離酶變大。NUNES[22]等人研究固定柚苷酶的過程中，固定化酶的Km值也比游離酶大，這表明底物固定化以后由于樹脂載體內(nèi)部的空間位阻和擴(kuò)散效應(yīng)造成酶與底物的親和性降低，反應(yīng)初速率有一定增大。

圖6 固定化α-L-鼠李糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot for immobilized α-L-rhamnosidase

2.3.4 半衰期及操作穩(wěn)定性

重組α-L-鼠李糖苷酶的半衰期如圖7所示，在6 h的時(shí)候，酶活下降為初始酶活的50%。隨著操作次數(shù)的增多，反應(yīng)體系中固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活變化情況如圖7所示。

A-固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期；B-固定化α-L-鼠李糖苷酶操作穩(wěn)定性圖7 固定化α-L-鼠李糖苷酶的半衰期和操作穩(wěn)定性Fig.7 Half-life and operation stability of immobilized α-L-rhamnosidase

固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活隨著反應(yīng)次數(shù)的增多而逐步上升。出現(xiàn)這種情況的原因可能是初始階段的聚乙烯醇-海藻酸鈉載體強(qiáng)度較大但傳質(zhì)性能比較差，產(chǎn)生了一定的空間位組和屏蔽作用，從而對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響[16]。而后隨著反應(yīng)次數(shù)的增加，載體強(qiáng)度減弱，被包埋的酶漸漸與底物接觸，蘆丁轉(zhuǎn)化強(qiáng)度變大，連續(xù)使用了6次后凝膠顆粒基本上已經(jīng)處于透明膠化的狀態(tài)，但相對(duì)酶活還能保持在98.22%。說明該固定化α-L-鼠李糖苷酶有著比較好的操作穩(wěn)定性，利于重復(fù)利用，具工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的潛能。

3 結(jié)論

本文對(duì)重組黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行了5 L罐高密度發(fā)酵和酶固定化實(shí)驗(yàn)，并對(duì)固定化α-L-鼠李糖苷酶性質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定。通過采取不同甲醇流加量發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲醇添加的體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，酶活力達(dá)到最高2 766 U/mL ；采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%海藻酸鈉和體積分?jǐn)?shù)10%戊二醛交聯(lián)制作固定化α-L-鼠李糖苷酶，其最適溫度為40 ℃，最適pH為4.0，固定化α-L-鼠李糖苷酶的酶活為20 U/g，酶活回收率為32.88%。以高密度發(fā)酵α-L-鼠李糖苷酶并進(jìn)行固定化，為今后發(fā)酵工藝的進(jìn)一步放大及α-L-鼠李糖苷酶制備異槲皮苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。