劉動(dòng)斌，劉莉娜，吳敬，陳晟*

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

低聚半乳糖(galactooligosaccharides,GOS)是一種低分子量的功能性低聚糖，具有穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，在高溫和酸性條件下也不能夠被分解。此外，GOS具有黏度低，有較強(qiáng)的保濕性，不結(jié)合礦物質(zhì)，口感清爽，熱值較低，甜度僅為蔗糖的20%～40%，且著色性高，水分保持能力強(qiáng)，無不良質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味，亦不被人體消化酶所消化，具有良好的雙歧桿菌增殖活性[1]等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的食品添加劑。目前，GOS已廣泛應(yīng)用于嬰兒食品、烘焙食品和飲料等行業(yè)中[1-3]，其中日本對GOS的開發(fā)和利用位居世界前列[4]。在乳制品行業(yè)生產(chǎn)低乳糖牛奶和低聚半乳糖過程中，β-半乳糖苷酶起著關(guān)鍵作用。

β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)又稱為乳糖酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、霉菌等微生物中，具有水解乳糖的作用，在乳制品行業(yè)中用于降低乳制品中乳糖含量，減少乳糖不耐癥的發(fā)生。此外，β-半乳糖苷酶兼具轉(zhuǎn)糖苷的活性，能切割乳糖的β-1,4糖苷鍵，并將游離半乳糖殘基以β-1,3、β-1,4、β-1,6糖苷鍵連接到其它糖分子上，其中以β-1,4糖苷鍵為主[5]，工業(yè)上主要依靠糖苷水解酶將半乳糖基從糖基供體轉(zhuǎn)移到對應(yīng)的糖苷受體形成糖苷鍵[6]，生產(chǎn)非消化性的功能性低聚半乳糖(GOS)。不同微生物來源的β-半乳糖苷酶合成GOS的能力存在一定差異，如來源于Escherichiacoli、Aspergillusniger的β-半乳糖苷酶的水解活性較強(qiáng)，而來源于Bacilluscirculans、Aspergillusoryzae、Kluyveromyeslactis的β-半乳糖苷酶則有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)苷活性[7-8]?？莶菅挎邨U菌是經(jīng)我國農(nóng)業(yè)部認(rèn)定的2種飼料添加菌種之一，也是美國食品藥物管理局(FDA)認(rèn)定的安全菌種[9]，是一種高效表達(dá)的食品安全的宿主菌，有利于食品用酶的工業(yè)化生產(chǎn)。來自極端嗜熱古菌硫礦硫化葉菌(SulfolobussolfataricusP2)的β-半乳糖苷酶具有較高的GOS轉(zhuǎn)化率，且該酶轉(zhuǎn)化溫度較高，熱穩(wěn)定性好，酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)時(shí)不易染菌的優(yōu)良特性，相對于其他常溫β-半乳糖苷酶，更具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。但鑒于該酶是胞內(nèi)表達(dá)，需要經(jīng)過細(xì)胞破碎才能獲取游離酶，獲取酶液的成本較高且回收率較低，此外后期酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后游離酶與產(chǎn)物分離復(fù)雜，這極大地限制了其在工業(yè)化中的應(yīng)用。酶的固定化技術(shù)包含固定化酶與固定化細(xì)胞，具有良好的儲存和操作穩(wěn)定性，在儲存較長的時(shí)間后，酶活力損失較少[10]，固定化酶與游離酶相比，反應(yīng)條件得到拓寬，在各種反應(yīng)條件相同的條件下，固定化酶比游離酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化效率更高[11]。經(jīng)反復(fù)使用后能夠提高酶的使用效率，并且易于在酶轉(zhuǎn)化結(jié)束后對產(chǎn)物進(jìn)行分離[12-13]。固定化細(xì)胞將游離的細(xì)胞固定于一定空間范圍內(nèi)，具有細(xì)胞密度較大，反應(yīng)速度快、產(chǎn)物的分離簡單、控制方便、細(xì)胞損失較少等優(yōu)點(diǎn)，在工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛使用[14-15]，其中使用最多的是包埋法固定化細(xì)胞。常用的包埋載體有海藻酸鈣、明膠、k-卡拉膠、瓊脂、二醋酸纖維素、三醋酸纖維素、血纖維蛋白、聚丙烯酰胺等[16]。

本研究室在前期工作中獲得1株具有較高轉(zhuǎn)苷活性的S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶的突變體F441Y[17]，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌和畢赤酵母KM71中的重組表達(dá)[17-19]。本研究成功地將S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。此外，采用細(xì)胞固定的方法，將產(chǎn)β-半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌進(jìn)行細(xì)胞固定化，并對其應(yīng)用于低聚半乳糖的生產(chǎn)進(jìn)行研究，最高得率為55%。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株BacillussubtilisCCTCC M 2016536，大腸桿菌JM109以及BL21(DE3)/pT7-7-F441Y[17]為本實(shí)驗(yàn)室保藏。表達(dá)質(zhì)粒pT7-7-F441Y，pBSMuL3保藏于本實(shí)驗(yàn)室，其中質(zhì)粒pT7-7-F441Y含有來源于S.solfataricusP2的β-半乳糖苷酶基因；克隆質(zhì)粒pMD19-T simple，購于TaKaRa(大連)生物工程有限公司。

1.1.2 主要試劑

鄰硝基苯基-β-葡萄糖苷(oNPG)購于美國的Sigma公司；α-乳糖、海藻酸鈉、戊二醛等其他試劑均為國產(chǎn)AR級。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

TB 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，KH2PO42.31，K2HPO4·3H2O 16.43。

3 L罐培養(yǎng)基(g/L)：大豆蛋白胨20，工業(yè)酵母粉15，甘油8，檸檬酸銨1，Na2SO32，(NH4)2SO42.68，K2HPO4·3H2O 14.6，NaH2PO4·2H2O 4.522，MgSO4·7H2O 1；金屬離子液3 mL/L。

補(bǔ)料培養(yǎng)基(g/L)：甘油100，大豆蛋白胨300，MgSO4·7H2O 7.9，金屬離子液40 mL/L。

金屬離子液(g/L)：CaCl20.5,ZnSO4·7H2O 0.18,MnSO4·H2O 0.1,EDTA二鈉 10.05,FeCl38.35,CuSO4·5H2O 0.16,CoCl2·6H2O 0.18。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 重組枯草芽孢桿菌β-半乳糖苷酶的構(gòu)建表達(dá)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中來源于S.solfataricusP2 的β-半乳糖苷酶基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，上游引物：5’-CCAAGCTTAAGGAGGATATTATGTATTCTTTCC CAAATTCT -3’(加粗為HindⅢ酶切位點(diǎn))；下游引物：5’-CGGGATCCTTAATGACGCAGAGGCTTGA -3’(加粗為BamHⅠ酶切位點(diǎn))。以質(zhì)粒pT7-7-F441Y為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)。將擴(kuò)增出來的基因片段與pMD19-T simple載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單克隆至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h，然后進(jìn)行質(zhì)粒提取。質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ/BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證正確后進(jìn)行基因測序，將測序正確的質(zhì)粒記為pMD19-lacS。

將質(zhì)粒pMD19-lacS與表達(dá)載體pBSMuL3分別使用HindⅢ，BamHⅠ雙酶切；膠回收分別得到lacS與pBSMuL3片段，在T4連接酶的作用下16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至E.coliJM109涂布到含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆至LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h，然后進(jìn)行質(zhì)粒提取。將酶切驗(yàn)證及基因測序正確的重組質(zhì)粒記為pBSMuL3-lacS，用電轉(zhuǎn)化法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至B.subtilisCTCC M 2016536中，構(gòu)建菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS。構(gòu)建成功的重組菌于-80 ℃甘油管保藏。

1.3.2 菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS的發(fā)酵培養(yǎng)

1.3.2.1 種子培養(yǎng)

將在-80 ℃保存的甘油管活化后，接100 μL菌液于含100 μg/mL卡那霉素的種子培養(yǎng)基中(50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)8 h。

1.3.2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)8 h的種子液以5%的接種量接入含100 μg/mL卡那霉素的TB培養(yǎng)基中(50 mL培養(yǎng)基/250 mL三角瓶)；在37 ℃，200 r/min培養(yǎng)2 h后，33 ℃培養(yǎng)至24 h。

1.3.2.3 上罐發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)8 h的種子液以10%的接種量接入含100 μg/mL卡那霉素的發(fā)酵罐中；設(shè)置發(fā)酵參數(shù)：溫度33 ℃、pH 7、溶氧30%。其中pH用20%的磷酸與氨水進(jìn)行調(diào)節(jié)。第1次溶氧反彈后開啟流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。

1.3.3 重組枯草芽胞桿菌發(fā)酵分析方法

1.3.3.1 菌體濃度測定

用去離子水將發(fā)酵液稀釋到一定的倍數(shù)后，置于比色皿中，使用Unic 7200型分光光度計(jì)測定其在600 nm處的吸光值，并以等量的去離子水作為空白對照，計(jì)算得到菌體生物量(OD600)。

1.3.3.2 檢測方法

用高碘酸氧化法[20]測定發(fā)酵液中殘留的甘油。將發(fā)酵液用去離子水稀釋一定倍數(shù)后取1 mL于比色管中，再加入1 mL 0.015 mol/L高碘酸鈉溶液混勻，室溫10 min后加入2 mL 0.1%L-鼠李糖；混勻后加入4 mL Nash試劑，53 ℃水浴15 min充分顯色，在波長412 nm處測定反應(yīng)樣品的吸光值，計(jì)算發(fā)酵液中甘油殘留量。

1.3.3.3 發(fā)酵液中氮源殘留量的測定

向比色管中分別加入0.5 mL稀釋后的發(fā)酵液，然后加入1.1 mL去離子水，再向其中加入0.4 mL pH 8.04的磷酸鹽緩沖液(用10 mL KH2PO4與190 mL NaH2PO4混合配制)；最后向比色管中加入0.4 mL 20 g/L的茚三酮后混勻，在電爐上沸水浴15 min，取出后冷卻至室溫加水至10 mL。靜置15 min后在波長570 nm處測定吸光值，計(jì)算發(fā)酵液中殘留的氮源含量。

1.3.4 固定化細(xì)胞制備

將一定質(zhì)量的海藻酸鈉與明膠溶解于去離子水中，混勻形成均一透明的膠體。將發(fā)酵液離心后棄上清，用適量生理鹽水將菌體懸浮后加入到前面所配置的混合膠體中，充分混勻后用注射器將其滴加到氯化鈣溶液中(滴加時(shí)注意針頭與液面的距離并保持垂直)，形成直徑為2.0 mm左右的微球，后用蒸餾水洗至中性。加入一定濃度的戊二醛溶液，4 ℃放置2 h后用蒸餾水洗去多余的戊二醛，將固定化小球在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 β-半乳糖苷酶酶活力檢測

取適量發(fā)酵液離心棄上清收集菌體，用1 mL 0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液將菌體重新懸浮。使用超聲細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞破碎，離心收集上清即為胞內(nèi)粗酶液。配制20 mmol/LoNPG，取100 μL適當(dāng)稀釋的酶液、1 800 μL 0.1 mol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液在80 ℃保溫10 min后，加入100 μL底物，于80 ℃保溫10 min，立即加入1 mL 1 mol/L預(yù)冷的Na2CO3終止反應(yīng)并顯色，用分光光度計(jì)在波長420 nm處測定吸光值。酶活力單位定義：在上述分析條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmoloNP的酶量為1個(gè)活力單位。

固定化細(xì)胞酶活力的測定只需要將上述中100 μL適當(dāng)稀釋的酶液用一定質(zhì)量的固定化細(xì)胞代替，其他步驟相同。固定化酶活收率計(jì)算見公式(1)：

(1)

1.3.6 低聚半乳糖的檢測

取一定量pH 6.5，不同濃度的乳糖溶液，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入不同量的固定化細(xì)胞小球，在溫度80 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)不同時(shí)間，取樣后在沸水浴中處理10 min，離心取上清。

反應(yīng)液中，存在不同聚合度的低聚糖。低聚半乳糖中的轉(zhuǎn)移二糖的檢測條件是：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Thermo Aps-2 HYPERSIL (4.6 mm×250 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動(dòng)相體積分?jǐn)?shù)為78%乙腈/水溶液，流速和柱溫分別設(shè)置為0.8 mL/min和40 ℃。低聚半乳糖中的四糖、三糖以及乳糖和單糖的檢測條件是：Agilent 1200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Hi-PlexNa (300 mm×7.7 mm)，示差檢測器Agilent 2410；流動(dòng)相為純水，流速和柱溫分別為0.3 mL/min和80 ℃。

產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的計(jì)算見公式(2)：

(2)

低聚半乳糖為轉(zhuǎn)移二糖、轉(zhuǎn)移三糖和轉(zhuǎn)移四糖的總和。

1.3.7 固定化酶操作穩(wěn)定性研究

以pH 6.5的700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL 的固定化小球加量，置于80 ℃、150 r/min恒溫水浴搖床中反應(yīng)10 h后將反應(yīng)液移出，用pH 6.5的磷酸緩沖液清洗固定化小球至清洗液中檢測不到糖，加入底物進(jìn)行新一批的反應(yīng)，連續(xù)轉(zhuǎn)化10批。檢測每批低聚半乳糖生成量，計(jì)算各批次產(chǎn)率及固定化小球的殘余酶活，考察固定化酶的重復(fù)使用穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-半乳糖苷酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)

以質(zhì)粒pT7-7-F441Y為模板，PCR擴(kuò)增β-半乳糖苷酶全基因lacS，與pBSMuL3片段連接后轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，抽提質(zhì)粒后用雙酶切驗(yàn)證。如圖1-a所示，瓊脂糖核酸電泳中目的條帶出現(xiàn)的位置分別與理論值7 987 bp和1 479 bp相符，基因測序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒pBSMuL3-lacS構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pBSMuL3-lacS轉(zhuǎn)化至BacillussubtilisCTCC M 2016536中，獲得重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS。重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS在TB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵24 h后，取發(fā)酵液進(jìn)行超聲破壁處理。如圖1-b所示，SDS-PAGE中1號泳道出現(xiàn)的條帶位置與理論值56.6 kDa相符，對照組2號泳道在此處無目的條帶，且破壁上清液中β-半乳糖苷酶酶活力為9 U/mL，這說明β-半乳糖苷酶在枯草芽孢桿菌中表達(dá)成功。

圖1 重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建(a)和重組枯草芽孢桿菌的SDS-PAGE(b)Fig.1 Construction of recombinant Bacillus subtilis(a)and SDS-PAGE (b) of recombinant Bacillus subtilis

2.2 菌株B. subtilis/pBSMuL3-lacS 3L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵

對菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS進(jìn)行3 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵以探究其產(chǎn)酶水平。前期的發(fā)酵研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中碳源與氮源的濃度對菌體產(chǎn)酶有一定的影響，當(dāng)發(fā)酵液中碳源與氮源的濃度過高時(shí)，菌體生長過快不利于產(chǎn)酶，當(dāng)濃度過低時(shí)菌體產(chǎn)酶同樣受到抑制，當(dāng)發(fā)酵液中殘留碳源在0.3～0.38 mg/mL，殘留氮源在7～8 mg/mL時(shí)產(chǎn)酶最好。如圖2所示通過對發(fā)酵液中碳源和氮源殘留量的檢測，控制補(bǔ)料的速度，維持菌體以一定的速率生長，使β-半乳糖苷酶得以高效表達(dá)，發(fā)酵培養(yǎng)80 h時(shí)OD600達(dá)到120，胞內(nèi)酶活達(dá)到76.5 U/mL，相對于TB培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵液破壁上清液中β-半乳糖苷酶酶活力為9 U/mL，是搖瓶發(fā)酵的8.5倍。

圖2 3 L發(fā)酵罐高密度生產(chǎn)LacS發(fā)酵過程曲線Fig.2 3 L fermenter high density production LacS fermentation curve

2.3 固定化細(xì)胞研究

2.3.1 固定化載體的組分配比

分別以不同濃度的海藻酸鈉對菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS進(jìn)行細(xì)胞的固定化，并探究不同海藻酸鈉濃度下固定化細(xì)胞的相對酶活與酶活力回收率。如圖3所示，當(dāng)海藻酸鈉濃度逐漸增加時(shí)，固定化細(xì)胞的酶活力和酶活回收率均先升高后降低，在海藻酸鈉質(zhì)量濃度為20 g/L時(shí)固定化細(xì)胞的酶活力和酶活力回收率同時(shí)達(dá)最高點(diǎn)。當(dāng)海藻酸鈉濃度過低時(shí)，固定化載體對細(xì)胞的包埋不夠密實(shí)，在固定化小球制備和清洗過程中酶活力損失嚴(yán)重，酶活力與酶活力回收率均較低；當(dāng)海藻酸鈉濃度過高時(shí)，固定化載體包埋細(xì)胞過于緊密且固定化小球難以擠壓制備，酶反應(yīng)過程中底物與產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力過大，酶活力與酶活力回收率均較低。因此選擇質(zhì)量濃度為20 g/L的海藻酸鈉為固定化載體。

圖3 海藻酸鈉濃度對固定化細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of sodium alginate concentration on immobilized cells

該重組β-半乳糖苷酶為高溫酶，其酶反應(yīng)需要在高溫下進(jìn)行[17]。以海藻酸鈣為包埋材料不耐高溫，在制備固定化細(xì)胞的過程中加入明膠后用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)可有效增強(qiáng)其機(jī)械強(qiáng)度。因此，在固定化載體中分別加入不同濃度的明膠來探究不同濃度下相對酶活力與酶活力回收率。如圖4所示，在維持固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的基礎(chǔ)上，隨著明膠濃度的升高，其相對酶活與酶活力回收率均先升高后降低，且當(dāng)明膠質(zhì)量濃度為10 g/L時(shí)相對酶活與酶活力回收率達(dá)最高點(diǎn)。當(dāng)明膠濃度較低時(shí)其機(jī)械強(qiáng)度不足，酶活有部分損失；當(dāng)明膠濃度較高時(shí)其機(jī)械強(qiáng)度過高難以使所包埋的重組細(xì)胞發(fā)揮其應(yīng)有的酶活力。綜合以上原因最終選擇在質(zhì)量濃度為20 g/L海藻酸鈉中加入質(zhì)量濃度為10 g/L的明膠為固定化載體。

圖4 明膠加量對固定化細(xì)胞的影響Fig.4 Effect of gelatin dosage on immobilized cells

2.3.2 交聯(lián)劑濃度的分析

戊二醛作為一種功能性交聯(lián)劑，能夠與固定化載體中的海藻酸鈉和明膠發(fā)生交聯(lián)，也能夠使重組菌交聯(lián)到載體上，增強(qiáng)固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度以及重組菌的穩(wěn)定性。分別以不同濃度的戊二醛對固定化細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)，以探究其對固定化細(xì)胞的相對酶活與酶活力回收率的影響。如圖5所示，當(dāng)交聯(lián)用的戊二醛濃度較低時(shí)，沒有足夠的戊二醛與包埋載體進(jìn)行交聯(lián)，引起重組菌的泄露進(jìn)而導(dǎo)致酶活力降低，而戊二醛濃度較高時(shí)能夠有效增強(qiáng)固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度，減少酶活力的損失，且在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，獲得最佳的酶活力與酶活回收率。從固定化效果以及節(jié)約的角度考慮，最終選擇體積分?jǐn)?shù)為0.5%的戊二醛作為交聯(lián)劑的濃度。

圖5 戊二醛加量對固定化細(xì)胞的影響Fig.5 glutaraldehyde on the amount of fixed cells

2.3.3 β-半乳糖苷酶加酶量的確定

在前面固定化載體組分優(yōu)化的基礎(chǔ)上，向100 mL固定化載體中分別加入不同體積發(fā)酵液離心后的菌體量(同一批次發(fā)酵液，發(fā)酵時(shí)間24 h，OD600為12)，以探究不同加酶量對酶活力和酶活回收率的影響。如圖6所示，從隨著菌體量的增加，酶活力逐漸上升，但酶力活回收率卻逐漸降低；當(dāng)加入50 mL發(fā)酵液離心所得的菌體量時(shí)酶活力與酶活力回收率最優(yōu)。由于固定化載體單位體積包埋菌體量有限，菌體量過多時(shí)容易造成菌體泄露嚴(yán)重，酶活回收率降低。因此，考慮固定化載體包埋效率、減少成本，最終選擇每100 mL固定化載體中加入50 mL發(fā)酵液離心所得的菌體量。

圖6 菌體加量對固定化細(xì)胞的影響Fig.6 The effect of cell addition on immobilized cells

2.4 固定化細(xì)胞反應(yīng)條件對低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的影響

2.4.1 底物濃度

分別以不同濃度的乳糖為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。如圖7所示，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度低于700 g/L時(shí)低聚半乳糖產(chǎn)率逐漸增高，當(dāng)乳糖質(zhì)量濃度高于700 g/L時(shí)，低聚半乳糖產(chǎn)率基本保持穩(wěn)定，因此，綜合考慮成本與可操作性，選用質(zhì)量濃度700 g/L的乳糖作為底物。之后的研究底物均為此濃度。

圖7 乳糖質(zhì)量濃度對GOS產(chǎn)率的影響Fig.7 Effect of lactose concentration on GOS yield

2.4.2 固定化細(xì)胞用量

在質(zhì)量濃度為700 g/L的乳糖中分別加入不同量的固定化細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)苷反應(yīng)。如圖8所示，低聚半乳糖的產(chǎn)率隨著固定化細(xì)胞加入量的增加先上升后下降。由于該反應(yīng)是可逆反應(yīng)當(dāng)固定化細(xì)胞加入量低于1 U/mL時(shí)轉(zhuǎn)苷反應(yīng)正向進(jìn)行，GOS產(chǎn)率增加，當(dāng)固定化細(xì)胞加入量大于1 U/mL時(shí)，GOS產(chǎn)率達(dá)到最大值的時(shí)間縮短，反應(yīng)后期，低聚半乳糖又被水解，轉(zhuǎn)化率下降[21]。因此選擇1 U/mL固定化細(xì)胞加入量進(jìn)行反應(yīng)生產(chǎn)低聚半乳糖產(chǎn)率最高。

圖8 固定化細(xì)胞加量對GOS產(chǎn)率的影響Fig.8 Effect of the amount of immobilized cells on the yield of GOS

2.4.3 反應(yīng)時(shí)間

以質(zhì)量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量進(jìn)行反應(yīng)，分別在反應(yīng)進(jìn)行不同時(shí)間段取樣，以探究反應(yīng)時(shí)間對固定化細(xì)胞制備低聚半乳糖的影響。反應(yīng)體系中低聚半乳糖的產(chǎn)率如圖9所示，在12 h之前隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行，低聚半乳糖的產(chǎn)率逐漸升高，在12 h時(shí)之后，低聚半乳糖的產(chǎn)率緩慢下降。前期由于底物濃度較高反應(yīng)向正向進(jìn)行，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長生成的低聚半乳糖又被水解，產(chǎn)率下降。綜合考慮選擇12 h的反應(yīng)時(shí)間最宜。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對GOS產(chǎn)率的影響Fig.9 Effect of reaction time on the yield of GOS

2.4.4 固定化細(xì)胞操作穩(wěn)定性的研究

固定化細(xì)胞以質(zhì)量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量反應(yīng)12 h為一個(gè)轉(zhuǎn)化過程。如圖10所示，隨著轉(zhuǎn)化次數(shù)的增加，低聚半乳糖的產(chǎn)率逐漸下降，連續(xù)轉(zhuǎn)化第6次時(shí)的低聚半乳糖產(chǎn)率仍具有41.6%，與轉(zhuǎn)化第1次時(shí)的低聚半乳糖產(chǎn)率55.1%相比，能夠達(dá)到第1次低聚半乳糖轉(zhuǎn)化率的75.5%?？梢钥闯鲈摴潭ɑ妇哂休^好的持續(xù)利用性及較高的低聚半乳糖生產(chǎn)能力。

圖10 固化酶的使用穩(wěn)定性Fig.10 Curing enzyme stability of use

3 結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了來源于極端嗜熱古菌硫礦硫化葉菌的β-半乳糖苷酶突變體F441Y在枯草芽孢桿菌中的異源表達(dá)，構(gòu)建菌株B.subtilis/pBSMuL3-lacS。對重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵80 h獲得了較好的表達(dá)水平，最終酶活達(dá)76.5 U/mL。

對重組菌B.subtilis/pBSMuL3-lacS進(jìn)行細(xì)胞固定化條件優(yōu)化。結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度20 g/L的海藻酸鈉、質(zhì)量濃度10 g/L的明膠，戊二醛交聯(lián)體積分?jǐn)?shù)為0.5%，菌體加量為每100 mL固定化載體中加入50 mL發(fā)酵液離心菌體條件下，固定化顆粒以及酶活回收率最高，該固定化方法簡單易行，酶活力回收率高。在上述條件下，以質(zhì)量濃度700 g/L的乳糖為底物，1 U/mL固定酶加入量反應(yīng)12 h進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)，最終低聚半乳糖的產(chǎn)率達(dá)到55.1%。優(yōu)化后的固定化細(xì)胞反應(yīng)體系連續(xù)使用6次后低聚半乳糖的產(chǎn)率依舊有41.6%?？梢钥闯鲈摴潭ɑ?xì)胞具有良好的操作穩(wěn)定性及較高的低聚半乳糖合成能力，為固定化細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖提供參考。