丁霞， 李巧玉，劉凡，曾偉主，陳堅(jiān)， 堵國成， 方芳*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 4(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)，是在發(fā)酵食品中檢出的一種致癌物質(zhì)[1]。2007年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將EC正式歸類為2A類致癌物質(zhì)[2]。酒精飲料中含有EC對食用消費(fèi)者健康的危害最大。同從發(fā)酵食品攝入EC相比，如果人類飲用一定量的酒精飲料，人類患癌的概率會大大增加[3]，因此，發(fā)酵食品及酒精飲料中含有的EC對人體構(gòu)成的危害不容小覷，應(yīng)采取有效措施進(jìn)行控制和減少[4]。

白酒是中國傳統(tǒng)的飲料酒，主要以大米、小麥、高粱、玉米和糯米為原料，以酒曲為發(fā)酵劑，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌等過程制成[5]。在酒精飲料中，尿素作為EC的前體物質(zhì)之一，會直接影響EC的含量。尿素一部分由原料本身帶入，一部分由酵母分解精氨酸代謝生成[6]。因此，去除尿素可以達(dá)到減少EC的目的。由于白酒特殊的生產(chǎn)工藝以及復(fù)雜的體系，使得能夠降解白酒中EC和尿素的水解酶與一般的脲酶相比，必須能夠耐受酸性環(huán)境和具備一定的乙醇耐受性，才可以去除白酒中的尿素，從而減少EC的含量[7-8]?，F(xiàn)如今，去除酒精飲料中EC主要從控制生產(chǎn)工藝、改造生產(chǎn)菌尿素代謝途徑、添加酸性脲酶減少尿素、添加EC降解酶等幾個(gè)方面。而應(yīng)用生物酶法在降低飲料酒中尿素的同時(shí)，還能保證食品的安全性，是一種具有潛在應(yīng)用價(jià)值的策略。脲酶(Urease)，可催化水解尿素，生成二氧化碳、水和氨[6]。從20世紀(jì)80年代末就有學(xué)者對酸性脲酶展開研究[9-10]。1976年，酸性脲酶首次在小鼠的胃腸道中發(fā)現(xiàn)。目前，已經(jīng)有多種產(chǎn)酸性脲酶的菌株被分離出來，對它們酶學(xué)性質(zhì)做了一些研究[11-12]，同時(shí)對去除發(fā)酵酒中尿素進(jìn)行研究，尿素去除效果顯著。根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，脲酶已成功應(yīng)用于黃酒，葡萄酒和清酒中[13]，但脲酶價(jià)格昂貴，國內(nèi)酸性脲酶還未形成生產(chǎn)規(guī)模，而能夠投入到白酒中降解EC且對白酒風(fēng)味影響較小的酶的相關(guān)報(bào)道較少。

綜上所述，研究能夠降解白酒中尿素及EC的菌株，對于保證白酒的安全性具有一定的意義。本研究從濃香型白酒酒醅中分離得到1株能同時(shí)降解EC和尿素的菌株，并進(jìn)行模擬窖內(nèi)發(fā)酵，考察該菌株在白酒發(fā)酵體系中減少EC和尿素的能力，并對所產(chǎn)降解EC和尿素的水解酶進(jìn)行分離純化以及酶學(xué)性質(zhì)研究，為該菌株在降低酒精飲料等發(fā)酵食品中EC的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 酒醅

洋河濃香型白酒入窖酒醅，采自江蘇洋河酒廠股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS分離培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉粉5 g/L，酵母粉4 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 mL，K2HPO42 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸三胺2 g/L，MnSO40.05 g/L，MgSO40.2 g/L，納他霉素100 mg/L ，115 ℃滅菌15 min。

LB分離培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，納他霉素100 mg/L ，121 ℃滅菌15 min。

篩選培養(yǎng)基：用于篩選產(chǎn)脲酶或者氨基甲酸乙酯水解酶的菌株。配方為于LB培養(yǎng)基中添加3 g/L的尿素或者3 g/L氨基甲酸乙酯，并加入6 mg/L的溴甲酚紫。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

尿素：上海生工；氨基甲酸乙酯，D5-氨基甲酸乙酯，9-羥基占頓醇：Sigma公司；無水乙酸鈉，正己烷：國藥集團(tuán)；氮吹儀：上海比朗儀器有限公司；Sonics超聲破碎儀：南京新辰生物科技有限公司；Qpix420高通量篩選系統(tǒng)：美國Molecular Devices公司；PCR儀：美國Bio-Rad公司；酶標(biāo)儀：美國Thermo Fisher 公司；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS-QP2010)：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 降解EC及尿素菌株的篩選

初篩：稱取3 g酒醅于試管中，加入3 mL無菌生理鹽水，于漩渦振蕩器上充分振蕩混勻，并稀釋成合適倍數(shù)后取100 μL，涂布于分離培養(yǎng)基上，于30 ℃厭氧條件下培養(yǎng)數(shù)天。待平板上長出菌落后，運(yùn)用Qpix420高通量篩選系統(tǒng)(美國Molecular Devices公司)挑取單菌落接種至裝有篩選培養(yǎng)基的96深孔板中，30 ℃厭氧培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。由于脲酶或EC水解酶能與相應(yīng)底物反應(yīng)產(chǎn)生氨，使溴甲酚紫由黃色變紫色，因此根據(jù)這一現(xiàn)象選取培養(yǎng)基顏色由黃色變成紫色的菌株作為初篩目的菌株。

復(fù)篩：將能使初篩陽性菌株接種至MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)后期，取菌液于冷凍離心機(jī)中4 ℃條件下6 000 r/min離心15 min，收集菌體，并用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌菌體2次，離心收集菌體垂懸于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，超聲破碎并離心取上清液獲得粗酶。

1.3.2 脲酶和EC降解酶酶活測定

采用BERTHELOT REACTION比色法[8]。在比色管中加入200 μL酶液(以滅活的酶液為對照)，再加入800 μL 40 g/L尿素或40 g/L EC溶液，37 ℃反應(yīng) 20 min 后加入1.0 mL終止劑，振蕩混勻后加入1.0 mL顯色劑I和1.0 mL顯色劑II，混勻后37 ℃保溫20 min。反應(yīng)液用超純水定容至10 mL，在625 nm處檢測吸光值。

終止劑：10 g三氯乙酸，超純水定容至100 mL。

顯色劑Ⅰ：15 g苯酚，0.625 g亞硝基鐵氰化鈉，超純水定容至250 mL。

顯色劑Ⅱ：13.125 g氫氧化鈉，7.5 mL次氯酸鈉，超純水定容至250 mL。

酶活定義：在常壓、35 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘分解尿素或EC產(chǎn)生1 μmol銨離子的酶量為1個(gè)酶活單位U，如式(1)。

酶活/(U·mL-1)= ΔOD625×n×k/20

式中:20為反應(yīng)時(shí)間，min；ΔOD625為樣品與空白對照吸光值之差；k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的倒數(shù)；n為酶液稀釋倍數(shù)。

1.3.3 菌株鑒定

基因組提?。簩⒑Y選的菌株接入MRS培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)過夜，離心棄上清，收集菌體。使用細(xì)菌DNA提取試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)提取細(xì)菌基因組。

16S rDNA序列擴(kuò)增(50 μL)：2×TaqDNA 聚合酶25 μL，ddH2O 22 μL，上下游引物各1 μL(16S rDNA序列的引物為27F：5′- GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACG-3′)，模板1 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測序。將16S rDNA序列在National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，確定菌株的屬種。

1.3.4 濃香型白酒窖內(nèi)發(fā)酵

添加菌株用于降解白酒中EC及其前體尿素，是通過將菌株培養(yǎng)至對數(shù)后期，9 000 r/min離心20 min，并用生理鹽水洗滌2次后重懸菌體，取20 mL不同菌濃的菌液添加到150 g入窖酒醅(加入入窖酒醅里的最終菌濃為107、108、109CFU/g)，充分?jǐn)嚢杌靹?，分裝至三角瓶中，用發(fā)酵栓封口。以添加等體積的生理鹽水的酒醅為對照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)平行，30 ℃厭氧條件下培養(yǎng)，分別于0、5、10、20、30、45、65、70 d取樣。

1.3.5 尿素、EC的測定

尿素的測定：稱取不同天數(shù)的窖內(nèi)發(fā)酵酒醅10 g，加入10 mL超純水，并于超聲振蕩器中超聲均質(zhì)15 min，將混合液于8 000 r/min離心10 min，取400 μL樣品，加入600 μL 9-羥基占噸醇溶液和100 μL 0.1 moL/L鹽酸溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，再用0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后用于測定[7]。

色譜條件：色譜柱為Gemini-NX 5u C18(250 mm×4.6 mm)；流速為1 mL/min；柱溫為35 ℃；流動相A為0.02 moL/L乙酸鈉溶液，流動相B為乙腈，流動相C為去離子水。

氨基甲酸乙酯的測定：采用內(nèi)標(biāo)法[14-15]。稱取不同天數(shù)的窖內(nèi)發(fā)酵酒醅10 g，加入10 mL超純水，并于超聲振蕩器中超聲均質(zhì)15 min，將混合液于8 000 r/min離心10 min ，取2 mL樣品，加100 μL 2 mg/L D5-氨基甲酸乙酯溶液，混勻后，加樣到EC專用萃取柱上，將樣品緩慢倒入萃取柱中，并靜置15 min。隨后用15 mL二氯甲烷溶液以約1 mL/min流速進(jìn)行洗脫，室溫下氮吹至0.5 mL，用甲醇定容至2.0 mL，混勻后過0.22 μm有機(jī)濾膜，過濾液供GC-MS檢測[16]。

色譜條件：色譜柱為石英毛細(xì)管柱(J&W DB-WAX，30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；高純氦氣流速為1 mL/min。升溫程序：起始溫度50 ℃，維持1 min ，以8 ℃/min升溫至180 ℃，再以25 ℃/min使溫度升高為240 ℃，保持6 min。離子源溫度為230 ℃，接口溫度為220 ℃，激活電壓為0.5 kV。

1.3.6 酒醅中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

稱取10 g酒醅于50 mL離心管，用20 mL蒸餾水浸出，約30 min，10 000 r/min離心10 min，吸取8 mL上清液，加入3 g NaCl于頂空瓶中，再加10 μL薄荷醇內(nèi)標(biāo)(100 mg/L)，50 ℃下水浴萃取45 min后用GC-MS檢測[17]。

色譜條件：FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣量：1 μL；不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度50 ℃，維持2 min，以5 ℃/min升溫至190 ℃，再以15 ℃/min升溫至210 ℃，電離方式為電子電離[18]。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的計(jì)算方法為：

式中：S1:待測揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積；S2:內(nèi)標(biāo)物的峰面積；N:內(nèi)標(biāo)物濃度(100 μg/L)。

1.3.7 酶的純化

粗酶液的制備：解淀粉芽孢桿菌JP21在MRS培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，并收集菌體。在20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)中洗滌后重懸菌體，置于冰水浴中超聲破碎，4 ℃下10 000 r/min 離心30 min，收集上清。

硫酸銨沉淀：將粗酶液放置在冰上，一邊攪拌一邊緩慢加入硫酸銨粉末至一定飽和度，4 ℃靜止4 h，13 000 r/min 離心 20 min 收集 45%～80%飽和度的沉淀，重新溶于20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)中，并用相同的緩沖溶液透析過夜。

離子交換層析：將上述酶液5 mL上樣于已用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.5)平衡的HiTrap Q FF陰離子交換柱上，起始緩沖液A為20 mmol/L pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液，洗脫緩沖液B為含1 mol/L NaCl 的 20 mmol/L pH 7.5 的磷酸鹽緩沖溶液，采用梯度體積分?jǐn)?shù) 20% B，40% B，60%B，80% B，100% B 液洗脫，流速為1 mL/min，收集 2 mL/管，測定各管酶活，合并活性管并透析除鹽。

凝膠層析：將上述酶液上樣于已用平衡緩沖液(50 mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.5)平衡好的Superdex200層析柱上，用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，流速0.5 mL/min，每管收集1.8 mL，測定各管酶活，收集合并有酶活各管用于后續(xù)研究。

1.3.8 蛋白質(zhì)濃度測定

采用蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司 Bradford)測定蛋白質(zhì)含量。取5 μL不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白(0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5 mg/mL)于96孔板中，再取5 μL樣品到96孔板中，各孔加入250 μL G250染色液，用酶標(biāo)儀測定A595時(shí)的吸光度，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

1.3.9 解淀粉芽孢桿菌 JP21所產(chǎn)酶脲酶和EC水解酶酶學(xué)性質(zhì)研究

酶反應(yīng)的最適pH值：在不同pH緩沖溶液中(0.05 mol/L檸檬酸緩沖液，pH 3.5～6.5；0.05 mol/L磷酸緩沖液，pH 6.5～7.5；0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.5～8.5)使酶液與含有40 g/L的不同底物(尿素或EC)反應(yīng)30 min，以最高酶活為100%計(jì)算各pH值條件下的相對酶活，得到最適pH值。

酶反應(yīng)的最適溫度：將酶與含有40 g/L的不同底物(尿素或EC)分別在不同的溫度條件下(25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃)反應(yīng)30 min，以最高酶活為100%，計(jì)算各溫度下的相對酶活，得到最適反應(yīng)溫度。

酶的乙醇耐受性：將酶與含有40 g/L的不同底物(尿素或EC)在不同體積分?jǐn)?shù)乙醇緩沖液中(0～40%)反應(yīng)30 min，測定相應(yīng)條件下的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算各乙醇條件下相對酶活，考察乙醇對酶活性的影響。

酶的底物特異性：將酶分別與含有40 g/L的不同底物(0.05 mol/L的pH 5.5檸檬酸緩沖液，EC、氨基甲酸甲酯、氨基甲酸丁酯、乙酰胺、苯甲酰胺、尿素為底物)反應(yīng)，測定酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解尿素和EC的菌株分離篩選和鑒定

本研究采用高通量篩選技術(shù)，根據(jù)材料與方法里所述的顏色變化，從8萬多個(gè)分離自濃香型白酒酒醅的菌株中，篩選得到9株能夠使培養(yǎng)基顏色變化的菌株作為初篩目的菌株，對這9株初篩目的菌株進(jìn)行脲酶酶活和EC水解酶酶活檢測，得到1株能夠同時(shí)降解尿素和EC的菌株。對該菌株菌落形態(tài)特征進(jìn)行觀察(見圖1)，菌株鑒定方法參照《芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱功能菌的篩選與鑒定》文章中所述[19]，發(fā)現(xiàn)該菌株的菌落為乳白色，邊緣整齊，質(zhì)地粘稠，不透明，表面粗糙，菌體為桿狀。對該菌株16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對結(jié)果表明，該菌株16S rRNA基因序列與解淀粉芽孢桿菌的相似性為99%。因此，命名該菌株為BacillusamyloliquefaciensJP21。

圖1 菌株JP21在LB固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)(A)及顯微鏡檢圖(B) Fig.1 The colony morphology on LB agar (A) and microscopic examination (B) of strain JP21

將B.amyloliquefaciensJP21的16S rRNA序列和ureA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，并將16S rRNA序列和ureA基因序列經(jīng)BLAST比對后建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，由圖2分析可知它與解淀粉芽孢桿菌種在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育支上，因此可確定菌株為解淀粉芽孢桿菌種。

圖2 B. amyloliquefaciens JP21 16S rRNA基因(A)和ureA基因(B)系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Construction of phylogenetic trees of B.amyloliquefaciens JP21 based on 16S rRNA (A) and ureA (B) genes

通過對B.amyloliquefaciensJP21產(chǎn)酶培養(yǎng)條件的簡單考察，發(fā)現(xiàn)該菌株在37 ℃靜置培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液呈弱酸性并檢測到脲酶酶活，而在37 ℃搖床培養(yǎng)條件下的發(fā)酵液偏弱堿性且未檢測到脲酶酶活，因此該菌株培養(yǎng)條件是37 ℃靜置培養(yǎng)。

2.2 解淀粉芽孢桿菌JP21降解酒醅中EC和尿素

前期研究表明，白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程EC前體都有增加，在蒸酒過程會與乙醇反應(yīng)生成EC[5]。因此，在蒸酒前減少EC前體含量，可有效減少白酒中EC含量。為考察解淀粉芽孢桿菌JP21在模擬窖內(nèi)發(fā)酵過程中降解EC及其前體的能力，將B.amyloliquefaciensJP21按照不同濃度與入窖酒醅混合，進(jìn)行模擬白酒窖內(nèi)發(fā)酵。由圖3可以看出，對照組窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中尿素含量由39.3 mg/kg增加到53.0 mg/kg，增幅約25%；添加B.amyloliquefaciensJP21可不同程度減少酒醅中尿素含量，其中B.amyloliquefaciensJP21添加量為109CFU/g酒醅時(shí)，酒醅中尿素只增加17%，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)酒醅中尿素含量比對照減少12%。

圖3 窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中尿素含量變化Fig.3 Concentrations of urea in fermented gains during Chinese liquor fermentation

白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中，酒醅中EC含量也有所增加，特別是在發(fā)酵0～20 d，EC含量由32 μg/kg增加到52.3 μg/kg，增幅為39%。這可能由于此階段是產(chǎn)酒的過程，酒醅中的乙醇與前體尿素和瓜氨酸反應(yīng)，生成了EC[20]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對照組酒醅中EC含量達(dá)到52.3 μg/kg，增幅為39%(圖4)。在窖內(nèi)發(fā)酵過程添加B.amyloliquefaciensJP21，可顯著減少酒醅EC的含量。當(dāng)B.amyloliquefaciensJP21添加量分別為109、108和107CFU/g時(shí)，發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)酒醅中EC含量比對照分別減少17%、13%和11%。由于在酒醅中添加108CFU/g和109CFU/gB.amyloliquefaciensJP21對EC和尿素減少效果接近，今后應(yīng)用時(shí)可選取108CFU/g的添加量。

圖4 窖內(nèi)發(fā)酵過程酒醅中EC含量變化Fig.4 Concentrations of EC in fermented grains during Chinese liquor fermentation

2.3 添加菌株B. amyloliquefaciens JP21對白酒風(fēng)味的影響

風(fēng)味是影響白酒品質(zhì)的重要因素，雖然本研究采用的菌株是來自酒醅的內(nèi)源微生物，但是在窖內(nèi)發(fā)酵過程強(qiáng)化此菌，也可能會影響白酒的風(fēng)味[21]。因此，考察了添加108CFU/gB.amyloliquefaciensJP21進(jìn)行窖內(nèi)發(fā)酵，對發(fā)酵結(jié)束酒醅中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量的影響。由圖5可知，添加B.amyloliquefaciensJP21發(fā)酵結(jié)束時(shí)，酒醅中醇類減少了一種，酯類增加了一種，其他揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量基本無顯著變化。由此可以初步認(rèn)為，在窖內(nèi)發(fā)酵過程中強(qiáng)化B.amyloliquefaciensJP21對白酒中揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量無顯著影響。

2.4 B. amyloliquefaciens JP21降解EC和尿素酶的初步純化

B.amyloliquefaciensJP21具有同時(shí)降解EC和尿素的能力，為了識別降解酶的特性,拓展菌株和酶的應(yīng)用，對B.amyloliquefaciensJP21降解EC和尿素的酶進(jìn)行了初步純化和性質(zhì)研究。將超聲破碎后獲得粗酶經(jīng)過硫酸銨沉淀、離子交換層析和凝膠層析進(jìn)行了初步純化(表1)。通過多步純化，酶的比酶活力提高到34 U/mg，純度提高了16倍。對初步純化的降解EC和尿素的酶進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)圖中有3個(gè)條帶預(yù)測為脲酶的3個(gè)亞基UreC，UreA，UreB，對應(yīng)的分子質(zhì)量分別為61、15和14.5 kDa(圖6)。為進(jìn)一步確認(rèn)此降解酶的特性，在NCBI數(shù)據(jù)庫中尋找可能的解淀粉芽孢桿菌編碼降解尿素和EC的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌IT-45脲酶基因的編碼產(chǎn)物3個(gè)亞基大小分別為61.2, 13.5和11.5 kDa(Accession No. CP004065)，與圖6中初步純化獲得的降解EC和尿素酶的3個(gè)主帶接近。

表1 B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的初步純化Table 1 Purification of enzyme for degradation of EC andurea produced by B. amyloliquefaciens JP21

1-粗酶;2-硫酸銨沉淀組分;3-Hitrap Q FF分離樣品;4-Superdex 200分離樣品;M-Marker圖6 B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的初步純化Fig.6 Purification of EC and urea degrading enzyme produced by B. amyloliquefaciens JP21

2.5 B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的性質(zhì)研究

酒精飲料和發(fā)酵食品體系多為酸性體系，因此酸性EC和尿素降解酶更適用于食品發(fā)酵體系。由圖7可以看出，B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的最適反應(yīng)pH值相同，均為pH 5.5。酶在pH值4.5～6.5反應(yīng)條件下，相對酶活為最高的80%以上，因此，該菌株所產(chǎn)酶降解EC和尿素酶在酸性條件下活性較高。

圖7 pH值對B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶活性的影響Fig.7 Effects of pH on EC and urea degrading enzyme produced by B. amyloliquefaciens JP21

溫度會影響酶蛋白分子的結(jié)構(gòu)以及酶與底物的親和力。由圖8可知，B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，該酶在25～50 ℃的溫度范圍內(nèi)，有相對較高的酶活(酶活在70%以上)。白酒的窖內(nèi)發(fā)酵溫度一般在30 ℃左右[22]，因此，B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)的脲酶和EC降解酶能夠在白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中對減少尿素及EC發(fā)揮一定的作用。

圖8 溫度對B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶活性的影響Fig.8 Effects of temperature on EC and urea degrading enzyme produced by B. amyloliquefaciens JP21

通過考察酶在不同乙醇含量條件下的耐受性，可知B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)脲酶和EC水解酶應(yīng)用到酒中去除EC能否發(fā)揮一定的作用。酶的乙醇耐受性如圖9所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活性逐漸降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%的時(shí)候，殘余酶活為60%。這說明B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)脲酶和EC水解酶可耐受低濃度乙醇，具有在白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中減少EC的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖9 乙醇對B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶活性的影響Fig.9 Effect of ethanol on EC and urea degrading enzyme produced by B. amyloliquefaciens JP21

2.6 酶的底物特異性

由于B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶可同時(shí)降解EC和尿素，但是通過純化發(fā)現(xiàn)是一種酶可以同時(shí)降解EC和尿素。為進(jìn)一步確認(rèn)B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解酶的特性，考察了該酶對不同底物的作用效果。由圖10可以看出，該酶的最適反應(yīng)底物為尿素，也可以催化EC降解。結(jié)合初步純化的酶具有與脲酶相似的3個(gè)亞基的特性，認(rèn)為B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的酶為脲酶，具有分解尿素和EC的特性。

圖10 B. amyloliquefaciens JP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的底物特異性Fig.10 The substrate specificity of EC and urea degrading enzyme produced by B. amyloliquefaciens JP21

3 討論

本研究從濃香型白酒酒醅中分離得到1株能夠同時(shí)降解EC和尿素的菌株B.amyloliquefaciensJP21。將該菌用于白酒窖內(nèi)發(fā)酵，有效減少了酒醅中尿素和EC的含量，并且對白酒的風(fēng)味物質(zhì)無顯著影響。與來源于變幻青霉菌的EC水解酶相比[23]，在去除EC方面更具優(yōu)勢，因此該菌株具有在白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中減少EC的潛在應(yīng)用價(jià)值。

通過對B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)降解EC和尿素酶的酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，此酶為脲酶，具有催化EC和尿素分解活性，這與來源于Providenciasp.[24]所產(chǎn)脲酶特性相似。該酶的最適pH值為5.5，這與膠紅酵母所產(chǎn)EC降解酶，賴氨酸芽孢桿菌所產(chǎn)EC降解酶，肺炎克雷伯氏菌所產(chǎn)EC降解酶的最適pH 7.0不同[25-27]，相對而言，B.amyloliquefaciensJP21在減少酒精飲料中的EC更具優(yōu)勢。在考察溫度和乙醇對B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)脲酶活性影響的研究中發(fā)現(xiàn)，該酶最適反應(yīng)溫度為35 ℃，這與Lactobacillusreut所產(chǎn)脲酶最適反應(yīng)溫度65 ℃不同[28]，且B.amyloliquefaciensJP21所產(chǎn)脲酶能夠耐低濃度乙醇(體積分?jǐn)?shù)15%)，這一性質(zhì)與變幻青霉菌所產(chǎn)EC降解酶性質(zhì)類似[29]，由于白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中溫度的波動范圍在16～32 ℃[22]，B.amyloliquefaciensJP21更適合白酒窖內(nèi)發(fā)酵過程中減少EC。

綜上所述，B.amyloliquefaciensJP21可以在白酒混菌發(fā)酵體系中有效控制EC，在保證白酒安全性方面具有重要的應(yīng)用前景，并且在其他含有乙醇的發(fā)酵食品中(醬油和黃酒)也具有潛在減少EC含量的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)通過基因工程等手段對該酶基因在宿主菌中進(jìn)行異源表達(dá)有一定的研究意義。