劉富川，薛 勇，劉 健，甘禮惠，龍敏南

(廈門大學(xué)能源學(xué)院，福建 廈門 361102)

天然纖維素是自然界儲量最豐富的可再生生物質(zhì)，是生物質(zhì)燃料的主要原料.纖維素的多種加工利用過程依賴于微生物，尤其是絲狀真菌，其在降解生物質(zhì)過程中形成了一種高效、復(fù)雜的機(jī)制用來分泌一組水解酶，對纖維素降解起主要作用[1].然而，目前高效分泌纖維素酶和半纖維素酶的絲狀真菌僅有少數(shù)，如里氏木霉(Trichodermareesei)等被開發(fā)應(yīng)用[2].

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在絲狀真菌的纖維素酶表達(dá)調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用.木聚糖基因調(diào)控因子xlnR是第一個被鑒定的轉(zhuǎn)錄因子[3]，也是纖維素利用過程中的重要調(diào)控因子，其同源序列存在于多數(shù)絲狀真菌中.在里氏木霉中，Xyr1可調(diào)控纖維素酶基因和半纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄[4].對黑曲霉(Aspergillusniger)和粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中的CREA/1進(jìn)行敲除[5]，可有效抑制碳源代謝阻遏，提高其纖維素酶基因和半纖維素酶基因在非誘導(dǎo)表達(dá)條件下的表達(dá).另一個調(diào)控因子ACE1在里氏木霉和康氏木霉(T.koningii)中作為負(fù)調(diào)控因子，在槐糖和纖維素的誘導(dǎo)下，里氏木霉ACE1敲除菌株的主要纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達(dá)量均有所提高[6].

東方肉座菌(T.orientalis) EU7-22是由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)誘變、篩選獲得的木霉屬(Trichoderma)真菌，其不僅具有完整的纖維素酶系，而且與其他絲狀真菌相比具有較高的產(chǎn)纖維素酶能力，是一株具有工業(yè)化潛力的菌株，對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行研究具有重要意義.鋅指蛋白BglR是利用單核苷酸多態(tài)性檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)的特異性調(diào)控β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[7].在里氏木霉中bglr基因的缺失可使其纖維素酶活力在碳源纖維二糖誘導(dǎo)下提高[7]，且其同源蛋白COL-26在粗糙脈孢菌的生物碳氮平衡中起調(diào)控作用[8].因此，本研究克隆獲得東方肉座菌的BglR缺失菌株，并對其產(chǎn)纖維素酶活力、蛋白分泌量和相關(guān)產(chǎn)酶基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，探究bglr基因在東方肉座菌中的功能，以期為進(jìn)一步構(gòu)建高效降解纖維素的工業(yè)菌株提供理論參考.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

東方肉座菌EU7-22菌株為本實(shí)驗(yàn)室分離篩選獲得，大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株也為本實(shí)驗(yàn)室保存.pMD19-T載體質(zhì)粒購自寶生物工程(大連)有限公司；pUR5750質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存，它帶有真菌篩選標(biāo)記潮霉素抗性基因hph.

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉 10 g/L，pH 7.2.MM液體培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基)：葡萄糖20 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸二氫鉀15 g/L，硫酸鎂0.6 g/L，氯化鈣0.6 g/L.PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮，切塊)200 g 煮沸30 min后紗布過濾，將濾液定容至1 L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L.產(chǎn)酶培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：微晶纖維素(PH101，優(yōu)普惠，深圳)1%，小麥麩皮1%，蛋白胨0.5%，氯化鈣0.05%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.25%，吐溫-80 0.4%(體積分?jǐn)?shù)).上述化學(xué)藥品和試劑均為分析純，購自國藥化學(xué)試劑有限公司.

1.2 方 法

1.2.1 東方肉座菌基因組DNA、RNA的提取及cDNA的合成

將東方肉座菌接種至MM液體培養(yǎng)基中，置于溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h，過濾，收集菌絲，液氮研磨，使用CTAB法[9]提取基因組DNA,-20 ℃保存.用RNAiso Plus試劑(TaKaRa，日本)提取RNA，使用PrimeScript?RT試劑盒(TaKaRa，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA.RNA與cDNA均置于-80 ℃保存.

1.2.2 bglr基因及其上下游序列的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中將bglr基因與里氏木霉QM6a菌株(XM_006969261.1)、綠色木霉(T.virens)Gv29-8菌株(S. XM_014098216.1)和深綠木霉(T.atroviride)IMI 206040菌株(S. XM_014092063.1)的同源基因進(jìn)行序列比對，選擇保守區(qū)序列設(shè)計(jì)引物bglr-F和bglr-R，以東方肉座菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；膠回收產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過含有100 μg/mL氨芐青霉素的抗性LB平板篩選轉(zhuǎn)化子；再利用通用引物M13對獲得的陽性克隆子進(jìn)行PCR檢測和測序，將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對驗(yàn)證.

對bglr基因上游未知序列進(jìn)行克隆，簡并引物設(shè)計(jì)參照Liu等[10]的方法，設(shè)計(jì)bglr基因上游序列巢式引物bglr-U1、bglr-U2、bglr-U3(表1)，經(jīng)3次PCR反應(yīng)，對上游序列進(jìn)行擴(kuò)增，將所得產(chǎn)物進(jìn)行回收轉(zhuǎn)化，對陽性克隆子篩選后進(jìn)行測序.根據(jù)測序結(jié)果，進(jìn)而設(shè)計(jì)上游巢式引物bglr-U11、bglr-U22、bglr-U33(表1)以得到足夠長的上游同源臂，并進(jìn)行第2輪序列擴(kuò)增，方法與上述步驟相同.交錯式熱不對稱PCR(TAIL-PCR)簡并引物SP1～4見表1.

借助bglr基因下游序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的比對結(jié)果，根據(jù)其下游序列保守位點(diǎn)，設(shè)計(jì)下游簡并引物bglr-DF1和bglr-DR1(表1)，以東方肉座菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用與上游同源臂相同的方法進(jìn)行測序，得到東方肉座菌下游同源臂序列.

表1 本研究所用引物

Tab.1 Primers used in this study

引物名稱序列(5'→3')用途bglr-FCAGCTCTCATGCACCTACAATGbglr-RGCCGAAACCGTCAAAGATGbglr-U1TAAAGAACCTGCTGCTCGATGACGGbglr-U2ACGATGGACTCCAGTCCGGCCGAACGTGAGGCACTCCTTGACCATGbglr-U3AATGCGGTTATGGACCTTTGCGGCbglr-U11TGGGTCAGTCAGCAAGCGGAAGAGbglr-U22ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTCACGAGTTGCAGAGACGCTGAACGbglr-U33TCGCTTATTAGGCGGAGTCTGGGGTbglr-DF1TCMTCTCCGCVTWYGACCTSAGCGbglr-DR1CGCCTTTGCTCTTTGCTCGACATGTbglr基因及上下游未知序列克隆SP1ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAASP2ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTTSP3ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAASP4ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGTTAIL-PCRbglr-P1GCGTGCTGACCAGGTGAGATbglr-P2CATTGATGGATTCTGGCGTTATbglr-P3CGAAAGATCCCTGCAGGAAAGAAGCTGAGAGGCGACGATbglr-P4GGTAATCCTTCTTAAGCTTGGGCGGGCGAGCTCAACTTCAbglr-P5AAATCGCCAGCCTCTCCATbglr-P6GAGGTCGGCGAGATGCTCTACbglr-FATGACGTCGGCCGTCAAGCGCbglr-RCTACCGCAGTGTGTTGAAGTTGAGCPgpdA-yzCTATGCTCCAAGCTAGAGTCTCAGTtrpC-yzGAATCGGTCAATACACTACATGGCPgpdA-P2GATCTTTCGACACTGAAATACGTCTtrpC-P5AAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTGhph-FCGACAGCGTCTCCGACCTGAhph-RCGCCCAAGCTGCATCATCGAA構(gòu)建Δbglr∷hph敲除盒以及Δbglr轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證18S rRNA-YGFAGGCGCGCAAATTACCCAATCC18S rRNA-YGRGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGbgl1-YGFATCACCTACCCGCCTTCAbgl1-YGRTCTCGTCGTCGGATGTTG實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

注：M=A/C，V=G/A/C，W=A/T，Y=C/T，S=G/C，B=G/T/C，D=G/A/T.

1.2.3 原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化

東方肉座菌中原生質(zhì)體的制備參照Szewczyk等[11]的方法，并適當(dāng)優(yōu)化.將所得轉(zhuǎn)化子在潮霉素抗性平板上篩選，之后轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)5 d；在潮霉素抗性培養(yǎng)基上劃線并得到單菌落，再轉(zhuǎn)接至PDA固體培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)5 d后提取基因組DNA，-20 ℃保存.

1.2.4 Δbglr∷hph 敲除盒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物bglr-P1與bglr-P3、bglr-P4與bglr-P6(表1)，以東方肉座菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并通過1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，分別得到bglr基因的上、下游序列產(chǎn)物.以pUR5750質(zhì)粒為模板，利用引物PgpdA-P2與TtrpC-P5(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后得到潮霉素抗性基因表達(dá)盒.利用引物bglr-P2與bglr-P5(表1)，以3次PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行融合PCR，瓊脂糖凝膠電泳切膠回收后獲得Δbglr∷hph敲除盒.

1.2.5 酶活力和蛋白含量測定

將菌株接種至PDA固體培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)5 d，將1.0 mL密度為107mL-1的孢子懸液接入50 mL種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18 h，然后按照體積比1∶10接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min的搖床上培養(yǎng)，每隔24 h取樣，6 000 r/min下離心10 min，收集上清酶液，測定酶活力[12-13].測定相關(guān)酶活力所用底物見表2，每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol還原糖或?qū)ο趸椒铀璧拿噶慷x為1個酶活力單位(IU).用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)測定酶液中的蛋白含量，方法參照試劑盒說明書.

表2 活力測定實(shí)驗(yàn)的酶以及所用底物

Tab.2 Enzymes and substrates for activity assays

酶底物濾紙酶定量濾紙,Whatmanβ-葡萄糖苷酶水楊苷,Sigma內(nèi)切葡聚糖酶羧甲基纖維素鈉,國藥(分析純)外切葡聚糖酶對硝基苯纖維二糖苷,Sigma木聚糖酶木聚糖,甘蔗渣提取

1.2.6 轉(zhuǎn)化子菌落生長速度與表型分析

用ddH2O將孢子稀釋至107mL-1，點(diǎn)接1 μL于以2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)葡萄糖、1%微晶纖維素、1%纖維二糖、2%羧甲基纖維素鈉分別作為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上，各3個平行平板.從培養(yǎng)36 h開始，每隔12 h測量菌落的直徑，連續(xù)培養(yǎng)4 d后觀察菌落生長表型.

1.2.7 qRT-PCR

分別取培養(yǎng)48和72 h后的發(fā)酵液，4 000 r/min離心5 min獲得菌絲體，稱取200 mg加入液氮研磨，用RNAiso Plus試劑從原始菌和Δbglr敲除菌中提取RNA，用PrimeScript?RT 試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以18SrRNA基因?yàn)閮?nèi)參，采用嵌合染料SYBR Green Ⅰ進(jìn)行qRT-PCR,分析目的基因的相對表達(dá)量[14],所用引物見表1.

圖1 基因bglr(a)及其編碼蛋白BglR保守區(qū)(b)的示意圖Fig.1 Sketch maps of bglr gene(a) and the conservative domain in BglR(b)

2 結(jié)果與分析

2.1 東方肉座菌bglr基因克隆及生物信息學(xué)分析

用DNAMAN軟件將測序結(jié)果進(jìn)行拼接，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核酸序列比對，在東方肉座菌中得到了總長度為5 878 bp的基因序列，包括bglr基因編碼序列2 204 bp(包含1個位于784～839 bp的內(nèi)含子)、上游同源臂序列1 671 bp和下游同源臂序列2 003 bp；使用Primer Premier 5.0軟件將其翻譯為715個氨基酸殘基的蛋白序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行蛋白序列比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白屬于Zn(Ⅱ)2C6型鋅指蛋白(圖1).將東方肉座菌bglr基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(登錄號MG720023).

采用鄰接(neighbor-jointing)法使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果表明bglr基因在真菌中具有較高的同源性(圖2)，其中與里氏木酶的同源性為87%，與Isariafumosorosea的同源性為77%，與Purpureocilliumlilacinum的同源性為69%.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在絲狀真菌產(chǎn)纖維素酶過程中起關(guān)鍵作用，但僅有少數(shù)調(diào)控因子(如碳阻遏代謝調(diào)控因子Cre1/A)的保守序列存在于整個真菌家族中，而大多數(shù)僅限于真菌種類的亞群[1].轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR在真菌中廣泛存在，但BglR在不同菌株中表現(xiàn)出的功能也不同，例如在里氏木霉中正向調(diào)控β-葡萄糖苷酶活力[7]，而在斜臥青霉(Penicilliumdecumbens)中則對該酶活力起負(fù)調(diào)控作用[15].

2.2 Δbglr敲除盒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

以東方肉座菌基因組DNA為模板用引物bglr-P1與bglr-P3克隆得到大小為2 069 bp的上游同源臂，用bglr-P4與bglr-P6得到大小為1 994 bp的下游同源臂；進(jìn)而用引物bglr-P2與bglr-P5，以上、下游同源臂片段和潮霉素表達(dá)盒為模板進(jìn)行融合PCR，得到大小為8 047 bp的Δbglr∷hph敲除盒(圖3).

圖2 東方肉座菌bglr基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of the bglr gene in T. orientalis

圖3 Δbglr∷hph敲除盒構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證引物示意圖Fig.3 Schematic map of constructing Δbglr∷hph deletion cassette and primers for PCR identification of the Δbglr transformant

(a) 驗(yàn)證bglr基因序列；(b) 驗(yàn)證hph基因序列；(c) Δbglr∷hph 敲除盒上游定位；(d) Δbglr∷hph 敲除盒下游定位.M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，(a)中為1 000 bp，(b)～(d)中為5 000 bp；1.EU7-22原始菌；2.Δbglr轉(zhuǎn)化子.圖4 Δbglr轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證Fig.4 PCR products verification of the Δbglr transformant by agarose gel electrophoresis

將潮霉素抗性平板篩選得到的轉(zhuǎn)化子分別以原始菌EU7-22和轉(zhuǎn)化子Δbglr的基因組DNA作為模板，用引物hph-F與hph-R進(jìn)行PCR，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中檢測到大小約為811 bp的潮霉素抗性基因片段，而EU7-22中并無條帶出現(xiàn)，證明敲除盒成功轉(zhuǎn)入(圖4(a)).用引物Cbglr-F和Cbglr-R對轉(zhuǎn)化子bglr基因進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，結(jié)果如圖4(b)所示,在原始菌EU7-22中，擴(kuò)增出bglr基因條帶(長度2 204 bp)，而轉(zhuǎn)化子Δbglr中相同位置未出現(xiàn)該條帶，說明bglr基因在轉(zhuǎn)化子中成功敲除.用引物bglr-P1與PgpdA-yz進(jìn)行PCR擴(kuò)增定位，結(jié)果如圖4(c)所示，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中擴(kuò)增出長度為2 933 bp的條帶，在原始菌EU7-22中相同條件下相同位置沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，可見敲除盒在bglr基因上游區(qū)域發(fā)生了同源重組.類似地，用引物bglr-P6與TtrpC-yz進(jìn)行PCR擴(kuò)增定位，結(jié)果如圖4(d)所示，在轉(zhuǎn)化子Δbglr中擴(kuò)增出長度為3 316 bp的條帶，而原始菌EU7-22中未出現(xiàn)相同條帶，說明敲除盒在bglr基因下游區(qū)域插入位點(diǎn)正確.經(jīng)驗(yàn)證，敲除盒成功導(dǎo)入到轉(zhuǎn)化子Δbglr并且產(chǎn)生了雙同源交換，即得Δbglr突變菌.

(a) 濾紙酶活力；(b) 內(nèi)切葡聚糖酶活力；(c) β-葡萄糖苷酶活力；(d) 外切葡聚糖酶活力；(e) 木聚糖酶活力；(f) 蛋白含量.圖5 東方肉座菌EU7-22和Δbglr突變菌的酶活力與蛋白含量Fig.5 Enzyme activities and protein concentrations in T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant

2.3 Δbglr突變菌產(chǎn)酶和蛋白含量的變化

以1%微晶纖維素和1%麩皮作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基的誘導(dǎo)物，分別培養(yǎng)原始菌EU7-22和突變菌Δbglr，每隔24 h取發(fā)酵液測定酶活力和蛋白含量，共培養(yǎng)5 d，每個時(shí)間點(diǎn)取3個平行樣.如圖5所示，突變菌Δbglr的濾紙酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶活力及蛋白含量的最高值分別升高39%，22%，16%和20%，β-葡萄糖苷酶活力下降47%，而內(nèi)切酶活力無明顯變化.這表明BglR對東方肉座菌的β-葡萄糖苷酶活力起正調(diào)控作用，使水解產(chǎn)物減少，減小了代謝系統(tǒng)中葡萄糖的反饋抑制作用，進(jìn)而使其他酶的活力升高.

圖6 qRT-PCR分析bgl1基因表達(dá)量Fig.6 qRT-PCR analysis of the bgl1 gene expression

2.4 β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)的qRT-PCR分析

在1%微晶纖維素和1%麩皮的誘導(dǎo)下，利用qRT-PCR分析原始菌EU7-22與突變菌Δbglr中主要β-葡萄糖苷酶基因bgl1的表達(dá)量，以內(nèi)參基因18SrRNA校正，結(jié)果顯示原始菌發(fā)酵培養(yǎng)48和72 h后的表達(dá)量分別為突變菌的6.89倍和10.41倍(圖6).該結(jié)果與突變菌的β-葡萄糖苷酶活力較原始菌降低(圖5(c))相吻合，說明BglR對東方肉座菌bgl1基因的表達(dá)起正調(diào)控作用.

2.5 發(fā)酵液pH值變化分析

對菌株EU7-22和Δbglr在不同時(shí)間段發(fā)酵液的pH值進(jìn)行測定，結(jié)果如圖7所示，兩菌株的發(fā)酵液pH值變化曲線差異明顯：原始菌EU7-22發(fā)酵液的pH值在24 h時(shí)下降到最低值4.6，后隨發(fā)酵時(shí)間增加而逐漸升高，在120 h時(shí)達(dá)到6.6；而突變菌Δbglr發(fā)酵液的pH值先升高，然后快速降低，在72 h時(shí)達(dá)到最低值4.7，后隨發(fā)酵時(shí)間逐漸升高，在120 h時(shí)與原始菌EU7-22發(fā)酵液趨近一致.由此可見BglR的缺失對東方肉座菌發(fā)酵過程中的pH環(huán)境產(chǎn)生了影響，推測與其有機(jī)酸代謝變化相關(guān).

圖7 東方肉座菌EU7-22與Δbglr突變菌發(fā)酵液的pH值變化Fig.7 The supernatant pH value changes of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant

2.6 菌落生長速率測定和表型分析

研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR的缺失對菌落生長的影響，分別以2%葡萄糖、1%纖維二糖、1%微晶纖維素、2%羧甲基纖維素鈉作為碳源，培養(yǎng)4 d后對其表型進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖8所示,在4種培養(yǎng)基上突變菌Δbglr產(chǎn)孢子量均明顯少于原始菌EU7-22.進(jìn)而測定并比較在相同碳源平板上生長的兩菌株的菌落直徑生長速率，結(jié)果如圖9所示，突變菌Δbglr的菌落直徑生長速率均小于原始菌EU7-22.以上數(shù)據(jù)表明，BglR的缺失對東方肉座菌的生長產(chǎn)生了明顯影響.由于微晶纖維素?zé)o法溶解，在培養(yǎng)基中分散不夠均勻，難以直接測量菌落直徑，因此未給出定量數(shù)據(jù).

圖8 東方肉座菌 EU7-22 與 Δbglr 突變菌在不同碳源平板上的產(chǎn)孢子分析Fig.8 Analysis on spores production of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant with different carbon resources

圖9 東方肉座菌EU7-22與Δbglr突變菌在不同碳源平板上的菌落生長速率Fig.9 The colony growth rates of T. orientalis EU7-22 and the Δbglr mutant on different carbon resource plates

3 討 論

為研究BglR對東方肉座菌產(chǎn)酶特性的影響，根據(jù)在GenBank中比對的絲狀真菌bglr基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，得到了東方肉座菌bglr基因的部分序列；進(jìn)而通過TAIL-PCR對bglr基因上、下游未知序列進(jìn)行擴(kuò)增，克隆出包括上、下游同源臂在內(nèi)的bglr基因序列.通過同源重組雙交換方式得到了BglR缺失突變菌株Δbglr，并驗(yàn)證了調(diào)控因子BglR的缺失對產(chǎn)酶活力和蛋白分泌量的影響，以及不同碳源對菌株生長的影響.

纖維素酶活力測定結(jié)果表明，bglr基因的缺失可使東方肉座菌的濾紙酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶活力和蛋白含量上升，而使β-葡萄糖苷酶活力下降.對β-葡萄糖苷酶編碼基因bgl1表達(dá)水平的檢測結(jié)果表明，突變菌Δbglr中的表達(dá)量較原始菌顯著降低.此外，BglR的缺失對東方肉座菌在不同碳源培養(yǎng)基上的生長均造成了影響.β-葡萄糖苷酶屬糖苷水解酶，在碳阻遏代謝過程中對纖維素的水解起關(guān)鍵作用，是纖維素水解過程中的限速酶.在纖維素水解過程中，先由內(nèi)切葡聚糖酶與外切葡聚糖酶協(xié)同產(chǎn)生纖維二糖，而后纖維二糖被β-葡萄糖苷酶徹底水解成葡萄糖[16].微生物在生長代謝過程中會優(yōu)先利用環(huán)境中葡萄糖，當(dāng)葡萄糖的量降低時(shí)，纖維素酶的生產(chǎn)得到激發(fā)，從而實(shí)現(xiàn)對纖維素的降解.因此，本研究通過對突變菌Δbglr的酶活力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BglR在東方肉座菌中正調(diào)控β-葡萄糖苷酶.由于BglR的缺失，阻礙了菌株利用纖維素/纖維二糖等碳源的生長，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BglR作為一個主要的潛在產(chǎn)糖信號，調(diào)控碳阻遏代謝循環(huán).濾紙酶活力代表纖維素酶的3種酶組分協(xié)同作用后的總酶活[17]，均相水溶性纖維素的水解速度高于非均相不溶性纖維素，其水解底物又依賴于不溶性纖維素的水解產(chǎn)物，因此不溶性纖維素水解是影響濾紙酶活力的限速步驟[18].本研究中BglR的缺失導(dǎo)致東方肉座菌β-葡萄糖苷酶活力降低，從而使誘導(dǎo)物纖維寡糖含量相對升高，繼而造成降解不溶性纖維素的外切葡聚糖酶活力升高，導(dǎo)致濾紙酶活力的增加.誘導(dǎo)物的增加也促使了木聚糖酶表達(dá)量增加，同時(shí)胞外蛋白量的增加，側(cè)面驗(yàn)證了胞外酶量的增加.

本實(shí)驗(yàn)室前期已對相關(guān)產(chǎn)酶基因的功能進(jìn)行了研究和鑒定[19-22]，目前東方肉座菌的全基因組測序工作正在進(jìn)行中.本研究揭示了東方肉座菌中BglR調(diào)控纖維菌酶生產(chǎn)相關(guān)的功能，對進(jìn)一步完善其纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為利用分子生物學(xué)方法構(gòu)建新的高效產(chǎn)纖維素酶工業(yè)菌株提供了參考.