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        日本鰻鱺γ-干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶(GILT)基因的克隆鑒定與表達分析

        2018-08-10 12:22:24張芳芳黃文樹
        廈門大學學報(自然科學版) 2018年4期

        陳 姍,張芳芳,黃 貝,黃文樹,3*

        (1.集美大學水產(chǎn)學院,2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心(集美大學),3.福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心,福建 廈門 361021)

        γ-干擾素誘導的溶酶體巰基還原酶(interferon-γ-inducible lysosomal thiol reductase,GILT)最初在人的單核細胞系U937中被發(fā)現(xiàn)[1],它首先被合成為一個35 ku的蛋白前體,然后通過甘露糖-6-磷酸受體(mannose 6-phosphate receptor)運輸?shù)桨掏分衃2-4],被溶酶體中的蛋白酶將其N端和C端前肽切除,形成一個30 ku的成熟肽[5-6].GILT的前體和成熟肽都具有還原二硫鍵的作用,且在pH 4.5~5.5的酸性條件下可發(fā)揮最佳效果[2-3,7].脊椎動物GILT蛋白的典型特征包括1個CQHGX2ECX2NX4C特征序列、1個CXXC活化位點、1個以上天冬氨酸殘基連接的糖基化位點(Asn-linked glycosylation site)和10~11個保守的半胱氨酸殘基[8-10].

        GILT在大多數(shù)的抗原遞呈細胞(如單核/巨噬細胞、B細胞、骨髓樹突狀細胞)中呈組成型表達,而在其他細胞(如成纖維細胞、表皮細胞、角化細胞)中可被γ-干擾素誘導[1-3,8,10].除了與抗原遞呈有關(guān),GILT也與負調(diào)控T細胞活化、中和胞外病原和清除細菌感染所造成的細胞碎片有關(guān)[11-12].此外,還有研究發(fā)現(xiàn)除了γ-干擾素,在PMA(phorbol-12-myristate-13-acetate)和脂多糖(LPS)的誘導作用下可促使THP-1細胞分泌促炎癥細胞因子和趨化因子,其中包括GILT[12-13].

        目前GILT基因在無脊椎動物和脊椎動物中均有報道.有研究顯示,在魚類中GILT基因主要在脾臟和腎臟中表達量最高,且經(jīng)LPS或細菌刺激后其mRNA表達水平上調(diào),這表明GILT可能在對細菌感染后宿主的免疫應(yīng)答中有重要作用[14-15].日本鰻鱺(Anguillajaponica)是世界性的經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類,但在其養(yǎng)殖過程中,細菌、寄生蟲、真菌和病毒性疾病的發(fā)生會給鰻鱺養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的損失[16].GILT是與免疫相關(guān)的基因,但鰻鱺中對其特征和功能卻未有報道.本研究克隆了日本鰻鱺GILT基因(AjGILT)的基因組和啟動子序列,并通過生物信息學方法分析了其編碼蛋白的序列特征;在此基礎(chǔ)上,進一步研究了其在日本鰻鱺不同組織中的表達情況,以及LPS、聚肌胞苷酸(PolyI:C)刺激和遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)感染不同時間后在不同組織中的表達變化,以期為了解AjGILT的功能奠定基礎(chǔ).

        1 材料與方法

        1.1 材 料

        日本鰻鱺,體質(zhì)量為(200±53) g,來源于福建省廈門市集美大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地;遲緩愛德華菌為集美大學水產(chǎn)學院實驗室保存菌種.

        1.2 AjGILT基因的cDNA序列克隆

        用Trizol?RNA提取試劑提取總RNA,經(jīng)無RNase的DNaseⅠ處理后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Transcription System(Promega,美國)制備cDNA模板,用SMART RACE試劑盒(Clontech,美國)制備5′-和3′-cDNA末端快速克隆(RACE)模板.設(shè)計RACE PCR引物(表1),分別擴增AjGILT-1和AjGILT-2的5′-和3′-端序列.PCR擴增條件為:第一輪94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min.第二輪94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,64 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,38個循環(huán);72 ℃延伸10 min.用引物AjGILT-1fl-F、AjGILT-1fl-R和AjGILT-2fl-F、AjGILT-2fl-R(表1)進行PCR擴增,分別驗證AjGILT-1和AjGILT-2的開放閱讀框(open reading frame,ORF)序列.PCR擴增條件為:94 ℃預變性3 min;然后94 ℃變性30 s,62 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,38個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min.擴增所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測,E.Z.N.A凝膠回收試劑盒(Omega,美國)回收目的條帶,然后連接到pMD19-T載體(TaKaRa,日本)上,并通過熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(Escherichcoli)DH5α感受態(tài)細胞中,最后篩選陽性克隆并通過測序驗證.

        1.3 AjGILT的基因組和啟動子序列克隆

        取日本鰻鱺肌肉組織100 mg,經(jīng)酚/三氯甲烷/異戊醇法提取基因組DNA.以基因組DNA為模板,用引物AjGILT-1fl-F、AjGILT-1fl-R和AjGILT-2fl-F、AjGILT-2fl-R(表1)分別擴增AjGILT-1和AjGILT-2的基因組序列.PCR擴增條件為:94 ℃預變性1 min;98 ℃變性10 s,62 ℃退火10 min,30個循環(huán);72 ℃延伸10 min.

        以日本鰻鱺基因組DNA為模板,用引物AjGILT-1pF、AjGILT-1pR和AjGILT-2pF、AjGILT-2pR(表1)分別擴增AjGILT-1和AjGILT-2的啟動子序列.PCR擴增條件為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60/58 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,38個循環(huán);72 ℃延伸10 min.

        1.4 AjGILT基因的表達分析

        樣品采集[17]:日本鰻鱺經(jīng)丁香酚及冰水麻醉后,斷尾取血于加有肝素鈉的離心管中,混勻,800g離心20 min,收集下層細胞,-80 ℃保存?zhèn)溆?;然后解剖采集肝臟、脾臟、腸、皮膚、胃、頭腎、中腎、鰾和鰓等組織/器官,分別于液氮冷凍后-80 ℃保存.

        誘導表達實驗:分別設(shè)置磷酸鹽緩沖液(PBS)對照組、LPS(Sigma,美國)刺激組(劑量為1 mg/100 g)、Poly I:C(Sigma,美國)刺激組(劑量為1 mg/100 g)、遲緩愛德華氏菌感染組(劑量為107cfu/100 g,cfu表示菌落形成單位),腹腔注射.注射8,16,24和72 h后采樣,每組每個時間點各采集6尾.

        實時熒光定量PCR(qRT-PCR):根據(jù)已獲得的AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列和基因組序列比對結(jié)果,設(shè)計跨內(nèi)含子區(qū)域的AjGILT-1和AjGILT-2擴增引物,分別為qAjGILT-1F、qAjGILT-1R和qAjGILT-2F、qAjGILT-2R(表1);同時以β-actin(GenBank:GU001950.1)為內(nèi)參基因,設(shè)計引物Actin178F2和Actin178R2(表1).以日本鰻鱺cDNA 為模板,PCR擴增AjGILT-1、AjGILT-2以及β-actin基因片段,回收目的片段進行連接、轉(zhuǎn)化和克隆鑒定后測序;再將測序正確的菌液擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒,測定質(zhì)粒濃度并以其為原液用滅菌水進行10倍稀釋,用LightCycler?480 SYBR Green試劑盒(Roche,德國)擴增,繪制標準曲線;然后在每塊96孔板中加入4~5個已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒樣品,剩余孔加入未知樣品.PCR程序為:95 ℃ 10 min;95 ℃ 20 s,62 ℃ 20 s,72 ℃ 25 s,共40個循環(huán).AjGILT-1和AjGILT-2的采集點溫度分別為83和81 ℃.反應(yīng)結(jié)束后計算未知樣品的拷貝數(shù).

        表1 本研究中使用的引物

        Tab.1 Primers used in this study

        引物名稱序列 (5'→3')用途UPMCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTRACENUPMACTCTGCGTTGATACCACTGCTTAjGILT-1F1GGTTCTGAAGCAGTGTATGGAGCAjGILT-1的3'-RACEAjGILT-1F2ATGTGACGGTTGGGCTGTACTATGAGAGAjGILT-1R1GCTACAGACCAGGGTGAAGAGAGATGACAjGILT-1的5'-RACEAjGILT-1R2TGGTCTCCCACTTCACAGAAGGAGCATAAjGILT-1fl-FTACGCAGTTGGGAGCTAAAjGILT-1序列驗證AjGILT-1fl-RGGATGCCATAGGAGACAGACAAjGILT-2F1ACGGAATGGTGTAGGACTCAAGAGATCGAjGILT-2的3'-RACEAjGILT-2F2CCAGCATGGAGAAGAGGAATGTTTGGGAjGILT-2R1GGCAGCAGGCTTGGGTCCCTTATACAAjGILT-2的5'-RACEAjGILT-2R2CACGTACTTGTGCGGCGGGTTCAAjGILT-2fl- FGAGCTAAGCAGTCTATAGCCAjGILT-2序列驗證AjGILT-2fl- RGTCAGTGATAGTGTTGGTGGATAjGILT-1pFAACCCTATCTAGTTCAAGAG啟動子序列擴增AjGILT-1pRGCATTCCATAGCTATTTCCAjGILT-2pFAGCAGGGTTGTGTTCATGACAjGILT-2pRGCATTCTCTGGCGATCTCqAjGILT-1FAACGCCGAGGAGACCGAGCqRT-PCRqAjGILT-1RCTCCGTGTGCTCCCCATTGATGqAjGILT-2FGGGTTGAGAAGTATTGCCTGGAqAjGILT-2RGAGGACACACGCCTCGATCATAActin178F2TCACCACCACAGCCGAAAGGActin178R2CGCAGGATTCCATTCCCAGGA

        1.5 序列分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        在NCBI網(wǎng)站(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進行序列比對分析;用ExPASy工具(http:∥web.expasy.org/)翻譯氨基酸序列和分析蛋白質(zhì)功能域;用SignalP 4.1 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信號肽序列;用NetNGlyc 1.0 Server (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc)分析糖基化位點;用NNPP工具 (http:∥www.fruitfly.org/seq/tools/promoter.html)預測基因調(diào)控區(qū)域;用Promoter 2.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)預測轉(zhuǎn)錄起始位點;用調(diào)控元件結(jié)合位點分析網(wǎng)站 (http:∥www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html)分析基因啟動子序列中潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點;用ClustalW 1.83和MEGA 5.0軟件比較氨基酸序列同源性和構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.數(shù)據(jù)用Excel 2010進行計算,用單因素方差分析法(one-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析,并用Dunnettt-檢驗(雙尾)進行多重比較.所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差的方式表示,p<0.05表示差異顯著,p<0.01表示差異極顯著.用GraphPad Prism v5.0軟件作圖.

        虛線表示預測的信號肽序列,橢圓框表示活性位點CXXC,陰影表示保守的半胱氨酸殘基,方框表示糖基化位點,單下劃線表示特征序列CQHGX2ECX2NX4C,雙下劃線表示終止信號(AATAAA).圖1 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的cDNA及預測的氨基酸序列Fig.1 cDNA and predicted amino acid sequences of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

        2 結(jié)果與分析

        2.1 AjGILT基因的鑒定及特征分析

        如圖1所示:AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列全長分別為840 bp和1 110 bp,編碼蛋白分別含260和255個氨基酸殘基,預測其分子質(zhì)量大小分別為29.11和28.15 ku,等電點分別為5.56和6.31.其中AjGILT-2含有保守的終止信號(AATAAA)和polyA序列.氨基酸序列分析結(jié)果顯示AjGILT-1和AjGILT-2均含有特征序列CQHGX2ECX2NX4C,分別位于124~139位和117~132位氨基酸殘基;活性位點CXXC,分別位于79~82和72~75位氨基酸殘基;2個糖基化位點,分別為N58、N68和N51、N135;11個保守的半胱氨酸殘基,預測可形成5個二硫鍵;N端分別含有21和22個氨基酸殘基組成的信號肽.

        克隆獲得AjGILT-1和AjGILT-2的基因組序列全長分別為4 657 bp和4 452 bp.與AjGILT-1和AjGILT-2的cDNA序列進行比對,發(fā)現(xiàn)AjGILT-1和AjGILT-2基因組序列均含有7個外顯子和6個內(nèi)含子(圖2),與其他脊椎動物(人、鼠、斑馬魚、大黃魚等)的GILT基因結(jié)構(gòu)[18]相似.

        線條表示內(nèi)含子,方框表示外顯子,數(shù)字表示各外顯子起止堿基的位置.圖2 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的基因組序列結(jié)構(gòu)Fig.2 The genomic sequence structures of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

        2.2 AjGILT氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析

        將AjGILT-1和AjGILT-2與其他物種GILTs的氨基酸序列進行多重比對,結(jié)果表明它們在蛋白特征結(jié)構(gòu)上高度保守(附錄圖S1,http:∥jxmu. xmu.edu.cn/upload/html/20180408.html).AjGILT-1與所比對的其他物種GILTs的氨基酸序列相似性為31%~63%,其中與大西洋鮭(Salmosalar)的相似性最高;而AjGILT-2與所比對的其他物種GILTs的氨基酸序列相似性為29%~62%,其中與虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的相似性最高.系統(tǒng)進化樹分析顯示:所選的GILT家族蛋白被分為脊椎動物和無脊椎動物兩大類,且在進化過程中來源于一個共同的祖先;其中AjGILT-1與AjGILT-2聚為一支,兩者又與大西洋鮭和虹鱒的GILTs聚為一支,表明親緣關(guān)系較近(圖3).

        2.3 AjGILT啟動子序列分析

        AjGILT-1與AjGILT-2啟動子分析結(jié)果表明兩者均存在多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,包括γ-干擾素活化序列(γ-interferon activation site,GAS)、特化蛋白1(specificity protein 1,Sp1)、轉(zhuǎn)錄因子CCAAT增強子結(jié)合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)等.不同的是AjGILT-1啟動子區(qū)存在多個核因子-1(nuclear factor-1,NF-1)、激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)結(jié)合位點及干擾素刺激反應(yīng)元件(interferon stimulation reaction element,ISRE),而在AjGILT-2啟動子區(qū)未發(fā)現(xiàn)(圖4).

        2.4 AjGILT基因在不同組織/器官中的表達

        利用qRT-PCR檢測AjGILT-1和AjGILT-2在健康日本鰻鱺的肝臟、脾臟、胃、血液、頭腎、中腎、鰓、腸、心臟、尾鰭、性腺、鰾、肌肉和皮膚共14個組織/器官中的表達情況,結(jié)果顯示(圖5):AjGILT-1和AjGILT-2在所檢測的組織/器官中均有表達;AjGILT-1在鰓和腸中表達量最高,其次為頭腎、中腎、鰾、皮膚、血液、性腺及肌肉,在肝臟、尾鰭和胃中的表達量極低;而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達量最高,其次為鰓、中腎、肌肉和心臟,在尾鰭和胃中表達量最低;此外,在性腺、脾臟、鰓、中腎、肝臟和胃中AjGILT-2的表達量都顯著高于AjGILT-1.

        2.5 LPS、PolyI:C刺激及E.tarda感染后AjGILT基因的表達變化

        通過qRT-PCR檢測LPS、PolyI:C刺激以及E.tarda感染8,16,24和72 h后,AjGILT-1和AjGILT-2在日本鰻鱺的鰓、頭腎和中腎中的表達情況,結(jié)果如圖6所示.

        AjGILT-1和AjGILT-2用▲標記,物種名后為各GILT對應(yīng)的GenBank登錄號.圖3 采用鄰接法構(gòu)建的AjGILT-1、AjGILT-2與其他物種GILTs的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of AjGILT-1,AjGILT-2 and other GILTs using neighbor joining method

        圖4 AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的啟動子序列分析Fig.4 Analysis of promoter sequences of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b)

        同一組織/器官中兩基因比較,*p< 0.05,**p<0.01(下同).圖5 AjGILT-1和AjGILT-2在日本鰻鱺不同組織/器官中的表達譜Fig.5 Expression profile of AjGILT-1 and AjGILT-2 in different tissues/organs of A. japonica

        在LPS刺激后,鰓中AjGILT-1的表達量在刺激8 h后有一定程度上調(diào),之后恢復,但均無顯著性差異;AjGILT-2的表達量在刺激24 h后有一定程度上調(diào),但在72 h后又顯著下調(diào).頭腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達量在刺激8 h后均顯著下調(diào),之后維持在較低水平.中腎中AjGILT-1的表達量在刺激8 h后顯著下調(diào),之后逐漸恢復;而AjGILT-2的表達量在刺激8 h后無顯著變化,但在16 h后顯著下調(diào),之后維持在較低水平.

        在PolyI:C刺激后,鰓中AjGILT-1的表達量僅在刺激24 h后顯著下調(diào),而AjGILT-2的表達量僅在刺激16 h后顯著上調(diào).頭腎中AjGILT-1的表達量在刺激24 h后顯著下調(diào),但在72 h后又有一定程度上調(diào);而AjGILT-2表達量在刺激16 h后有一定程度上調(diào),但在72 h后顯著下調(diào).中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達量均在刺激24 h后顯著下調(diào),之后恢復.

        在E.tarda感染后,鰓中AjGILT-1的表達量在感染8 h后有一定程度下調(diào),16 h后有一定程度上調(diào),之后恢復,但均無顯著性差異;而AjGILT-2的表達量僅在感染16 h后顯著上調(diào).頭腎中AjGILT-1的表達量在感染24 h后顯著下調(diào),之后維持在較低水平;而AjGILT-2的表達量在感染16 h后有一定程度上調(diào),但在72 h后又顯著下調(diào).中腎中AjGILT-1的表達量在感染16 h后顯著下調(diào),AjGILT-2的表達量在感染24 h后顯著下調(diào),之后均維持在較低水平.

        3 討論與結(jié)論

        本研究在日本鰻鱺中克隆獲得AjGILT-1和AjGILT-2基因,cDNA序列全長分別為840 bp 和1 110 bp,編碼蛋白均含有GILT家族的特征序列CQHGX2ECX2NX4C、活性位點CXXC、2個糖基化位點及11個保守的半胱氨酸殘基.其中活性位點CXXC是使巰基還原酶有活性和維持GILT結(jié)構(gòu)和功能所必需的,且CXXC中任何一個半胱氨酸殘基的突變均可使GILT的巰基還原酶失活[2].AjGILT的2個N-連接糖基化位點可能由甘露糖-6-磷酸衍生而來,其在酸性條件下對GILT前體轉(zhuǎn)運到溶酶體中是必需的[19].此外,保守的半胱氨酸殘基可形成二硫鍵,Collins等[6]提出在含有高濃度半胱氨酸的條件下,可最大程度催化溶酶體中二硫化物的還原.因此,AjGILT的功能可能涉及高濃度半胱氨酸的二硫鍵還原,進而在調(diào)節(jié)抗原遞呈和表位選擇中發(fā)揮作用[5].

        γ-干擾素發(fā)揮作用是在JAK-STAT信號通路中形成STAT1磷酸化同源二聚體,然后進入細胞核并通過結(jié)合目的基因啟動子區(qū)的GAS來激活目的基因的轉(zhuǎn)錄[9].目前研究表明人類黑素瘤中γ-干擾素誘導的GILT基因表達取決于STAT1的活化,活化的STAT1通過結(jié)合GILT啟動子中的GAS進而調(diào)節(jié)GILT基因表達[20].在斑節(jié)對蝦GILT基因的研究中,發(fā)現(xiàn)其通過JAK-STAT信號通路參與調(diào)節(jié)病毒感染后的一部分免疫應(yīng)答[21].本研究結(jié)果顯示AjGILT-1和AjGILT-2啟動子區(qū)均含有GAS,因此推測AjGILT-1和AjGILT-2在病毒感染后的免疫應(yīng)答中也可能通過JAK-STAT信號通路發(fā)揮作用.

        圖6 LPS、PolyI:C刺激及E.tarda感染后鰓、頭腎和中腎中AjGILT-1(a)和AjGILT-2(b)的表達變化Fig.6 The expression changes of AjGILT-1(a) and AjGILT-2(b) after LPS,PolyI:C stimulation and E. tarda infection in gill,head kidney and middle kidney

        目前在大黃魚[9]、斜帶石斑魚[22]、斑馬魚[23]、加州鱸[14]、暗紋東方鲀[18]、虹鱒[24]、金魚[15]、鱖魚[25]中檢測GILT基因的組織表達,結(jié)果顯示其均在脾臟和腎臟中表達最高;在文昌魚中,GILT基因在消化系統(tǒng)中表達最高[10].在皺紋盤鮑中,GILT基因在鰓、外殼膜和消化道組織中呈組成型表達[19].在合浦珠母貝中,GILT基因在鰓和消化腺中表達最高[26].本研究中AjGILT-1和AjGILT-2在檢測的14個組織中均有表達,AjGILT-1在鰓和腸中表達量最高,而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達量最高.這表明GILT基因在不同物種中的組織表達水平上存在差異.

        本研究結(jié)果顯示:LPS刺激后,鰓中AjGILT-1的表達量無顯著變化,而AjGILT-2在刺激72 h后顯著下調(diào);頭腎和中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達量均顯著下調(diào).PolyI:C刺激后,鰓中AjGILT-1和AjGILT-2表達量在刺激16 h后有一定程度上調(diào);頭腎中AjGILT-1的表達量在刺激24 h后顯著下調(diào),AjGILT-2的表達量在刺激72 h后顯著下調(diào);中腎中AjGILT-1和AjGILT-2的表達量均在刺激24 h后顯著下調(diào).E.tarda感染后,鰓中AjGILT-1和AjGILT-2的表達量在16 h后上調(diào);頭腎中AjGILT-1的表達量在24 h后顯著下調(diào),AjGILT-2的表達量在72 h后顯著下調(diào);中腎中AjGILT-1的表達量在16 h后顯著下調(diào),AjGILT-2的表達量在24 h后顯著下調(diào).從結(jié)果來看,整體上AjGILT-1和AjGILT-2在鰓中表達僅有少數(shù)變化,而在頭腎和中腎中整體表達變化更明顯.這可能是因為腎臟是先天性和適應(yīng)性免疫的主要反應(yīng)位點,也是淋巴細胞和巨噬細胞存在的主要組織,活化的淋巴細胞和直接刺激的巨噬細胞可誘導γ-干擾素,從而引起GILT基因表達的上調(diào);而鰓是非淋巴組織,雖然巨噬細胞在鰓中也可以被γ-干擾素刺激,但GILT表達在鰓中變化不明顯,暗示巨噬細胞在非淋巴組織中可能是參與先天性免疫而非適應(yīng)性免疫[9].

        綜上,本研究克隆了AjGILT-1和AjGILT-2兩個基因及其啟動子序列,對其進行了序列和結(jié)構(gòu)分析.qRT-PCR結(jié)果表明AjGILT-1在鰓和腸中表達量最高,而AjGILT-2在性腺、頭腎和脾臟中表達量最高.此外,AjGILT-1和AjGILT-2在病毒和細菌感染后的免疫應(yīng)答中可能有重要作用,這為日本鰻鱺的病害防治提供了一定的理論基礎(chǔ).

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