文/Jonas Dinser& Daiichi-Sankyo Europe GmbH& Munich, Germany &Sonja Krieger

利用2D-LC/MS/MS分析藥代動(dòng)力學(xué)研究中的藥物及其代謝物 // 本文展示將 Agilent InfinityLab二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)合使用，分析藥代動(dòng)力學(xué)研究中的藥物及其代謝物。二維液相色譜可避免出現(xiàn)共洗脫，因此能夠減少信號(hào)抑制以及交叉干擾風(fēng)險(xiǎn)，這些問題可能存在于復(fù)雜樣品的一維分析中。通過以更適合的洗脫方式將分析物引入質(zhì)譜離子源，2D-LC/MS/MS 分析方法的第二維可用于提高質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度。

在過去十年間，LC/MS/MS 已成為了藥代動(dòng)力學(xué)研究中用于分析藥物及其代謝物的一項(xiàng)成熟技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)除高選擇性、高分析靈敏度以及在峰歸屬或分子量信息等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)以外，也遇到了一些眾所周知的困難，如難以對(duì)血漿或細(xì)胞培養(yǎng)基等基質(zhì)復(fù)雜的生物樣品進(jìn)行分析。信號(hào)抑制的問題在低濃度分析物定量時(shí)尤為突出，可能造成定量限不達(dá)標(biāo)。就如何將 Agilent InfinityLab 二維液相色譜解決方案與 Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)結(jié)合在生物分析研究環(huán)境中克服上述難題，本文詳細(xì)列舉了兩個(gè)示例，分別是：

■ 二維分離方案如何避免出現(xiàn)共洗脫，以及如何在處理復(fù)雜分析物混合物時(shí)降低交叉干擾風(fēng)險(xiǎn)或減少信號(hào)抑制。

■ 如何利用第二維通過改變洗脫條件提高質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度，從而以更適合的洗脫液將分析物引入質(zhì)譜離子源，大幅提高定量限。

實(shí)驗(yàn)部分

設(shè)備

Agilent 1290 In fi nity II 二維液相色譜系統(tǒng)包括以下模塊：

■ 兩臺(tái) Agilent 1290 In fi nity II高速泵;

■ Agilent 1290 Infinity II Multisampler(G7167B)，配備冷卻裝置;

■ Agilent 1290 In fi nity II 高容量柱溫箱;

■ Agilent 1290 Infinity 閥驅(qū)動(dòng)，配備 2 位/4 通雙向閥;

■ 兩個(gè) Agilent 1290 Infinity閥驅(qū)動(dòng)，配備帶 40 μL 定量環(huán)的多中心切割閥;

■ 質(zhì)譜 (MS) 檢測(cè)采用配備安捷倫噴射流電噴霧離子源的Agilent 6495 三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行。

軟件

■ Agilent OpenLAB CDS ChemStation版，版本 C.01.07 SR2[263] 以及二維液相色譜軟件，版本 A.01.03 [025]；

■ Agilent MassHunter 工作站 LC/MS數(shù)據(jù)采集軟件，版本B.08.00，Build 8.0.8023.5 SP1；

■ Agilent MassHunter 工作站定量分析軟件，版本 B.07.01，Build 7.1.524.0。

化學(xué)品

LC/MS 級(jí)乙腈和甲醇購(gòu)自 TH Geyer；

LC/MS 分析所使用的甲酸和乙酸銨購(gòu)自 Sigma-Aldrich；

新制超純水產(chǎn)自配置 0.2 μm膜式終端過濾器的 ELGA Pureflex 2 水純化系統(tǒng)。

樣品和方法

1.利用二維液相色譜避免信號(hào)抑制和交叉干擾

進(jìn)行體外細(xì)胞懸液測(cè)定，鑒定負(fù)責(zé)候選藥物代謝的關(guān)鍵酶。在細(xì)胞懸液中對(duì)候選藥物（小分子）和多種酶特異性探針底物及相應(yīng)酶抑制劑進(jìn)行溫育。經(jīng)過一段時(shí)間后，收集樣品并分析代謝物的形成。為避免信號(hào)抑制或交叉干擾，采用色譜法對(duì)高豐度底物和抑制劑進(jìn)行了分離。進(jìn)樣溶液中含有細(xì)胞上清液與穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)溶液的混合物。方法參數(shù)如表 1所示。

圖1 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的 LC/MS/MS 分析結(jié)果

圖2 細(xì)胞培養(yǎng)上清液的 2D-LC/MS/MS 分析結(jié)果

2.二維液相色譜通過溶劑切換提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度通過體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定評(píng)估母體化合物（候選藥物）及其三種主要代謝物在培養(yǎng)基和細(xì)胞中的濃度。在預(yù)設(shè)溫育時(shí)間結(jié)束后采集樣品，加入非穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)，然后進(jìn)樣。方法參數(shù)如表 2 所示。

表1 用于避免信號(hào)抑制的二維液相色譜方法參數(shù)

結(jié)果與討論

利用二維液相色譜避免信號(hào)抑制和交叉干擾

在酶底物和抑制劑存在的條件下，體外細(xì)胞懸液測(cè)定得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中含有各種代謝物，因此屬于復(fù)雜混合物。圖 1所示為細(xì)胞培養(yǎng)上清液的 LC/MS/MS 分析結(jié)果。突出顯示的代謝物 M1 與濃度更高的底物和抑制劑發(fā)生了共洗脫。在此次LC/MS/MS 分析中，代謝物 M1 發(fā)生信號(hào)抑制，原因是該代謝物與豐度更高的底物和抑制劑發(fā)生了共洗脫。對(duì)于結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物，還可能有交叉干擾的問題。

要避免信號(hào)抑制和交叉干擾，分析細(xì)胞上清液時(shí)需要采用一種能夠?qū)⒋x物與底物和抑制劑分離開來的色譜方法。為確保將代謝物M1 與共洗脫底物和抑制劑分離，采用了中心切割 (MHC) 二維液相色譜。在基于時(shí)間的模式下，對(duì)代謝物M1 進(jìn)行中心切割，然后轉(zhuǎn)移至選擇性不同的第二維 (2D) 進(jìn)行分離。在第二維分離中，代謝物M1 與高豐度底物及抑制劑

發(fā)生充分分離，如圖 2 所示。代謝物 M1與高豐度底物及抑制劑的分離可避免信號(hào)抑制和交叉干擾。

利用基于時(shí)間的 MHC 二維液相色譜將16 個(gè)目標(biāo)代謝物從第一維轉(zhuǎn)移至第二維。這樣可使目標(biāo)化合物與底物及抑制劑進(jìn)一步分離，從而使分析的總運(yùn)行時(shí)間僅為 35分鐘。如果采用一維方法將 16 個(gè)目標(biāo)代謝物與底物及抑制劑分離開來，需要開發(fā)六種不同的方法，每種方法的運(yùn)行時(shí)間為 25 分鐘（相關(guān)數(shù)據(jù)未顯示）。在這種情況下，MHC 二維液相色譜的使用節(jié)省了大量的時(shí)間和樣品。

圖3 對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定樣品中一個(gè)母體化合物（棕色跡線）及其三個(gè)代謝物（M1-M3，藍(lán)色跡線）以及一個(gè)內(nèi)標(biāo)（綠色跡線）進(jìn)行LC/MS/MS 分析得到的結(jié)果

二維液相色譜通過溶劑切換提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度

在體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中，如果是一種母體化合物和一種代謝物，則必須通過基于內(nèi)標(biāo)的外部校準(zhǔn)法進(jìn)行定量。如果還有兩種代謝物，則必須進(jìn)行相對(duì)定量，因?yàn)闆]有相應(yīng)分析標(biāo)準(zhǔn)品。圖 3 所示為采用現(xiàn)有一維 LC/MS/MS 方法得到的分析結(jié)果。

方法優(yōu)化時(shí)測(cè)試了不同的色譜柱和溶劑組合。圖 4 所示為方法優(yōu)化過程中得到的兩幅 LC/MS/MS 色譜圖。圖 4A 中采用的是與圖 3 現(xiàn)有 LC/MS/MS 方法類似的條件。在上述條件下，全部三種代謝物(M1–M3) 均實(shí)現(xiàn)了彼此分離以及與母體化合物和內(nèi)標(biāo)的分離，但所選溶劑導(dǎo)致質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度受到影響。向流動(dòng)相中加入乙酸銨和甲醇，質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度得到大幅提升，但代謝物 M1–M3 之間的分離以及與母體化合物和內(nèi)標(biāo)之間的分離受到了影響，如圖 4B 所示。代謝物 M1 與 M3 的共洗脫問題尤為嚴(yán)重，因?yàn)槿N代謝物的質(zhì)量離子對(duì)相同，因此需要通過色譜分離。

圖4 LC/MS/MS 方法開發(fā)中得到的色譜圖

圖5 2D-LC/MS/MS 方法開發(fā)中得到的第一維色譜圖

圖6 對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定樣品中一個(gè)母體化合物（棕色跡線）及其三個(gè)代謝物（M1–M3，藍(lán)色跡線）以及一個(gè)內(nèi)標(biāo)（綠色跡線）進(jìn)行 2D-LC/MS/MS 分析得到的結(jié)果

為了達(dá)到水和乙腈流動(dòng)相中加入甲酸后的分離效果，同時(shí)擁有流動(dòng)相中加入乙酸銨和甲醇后的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度，本研究利用多中心切割將兩種分離方法在二維液相色譜方法設(shè)置中進(jìn)行了結(jié)合。在第一維中，將流速提高至 0.9 mL/min 以加快分析速度。圖 5 所示為最終的第一維分離結(jié)果。利用基于時(shí)間的中心切割法將五個(gè)目標(biāo)峰轉(zhuǎn)移至第二維。在第二維中，采用快速梯度（第二維周期 1.0 分鐘）將化合物捕集到第二維色譜柱，然后用第二維溶劑洗脫至質(zhì)譜離子源，以提高檢測(cè)靈敏度。對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定樣品進(jìn)行 2D-LC/MS/MS分析后得到的第二維色譜圖如圖 6 所示。與原始 1D-LC/MS/MS 方法中代謝物M1 61533 的響應(yīng)值（圖 3）相比，2D-LC/MS/MS 方法中代謝物 M1的響應(yīng)值達(dá)191646（圖 6），質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度提高了 15 倍，同時(shí)進(jìn)樣量從 5 μL 降至 1 μL。2D-LC/MS/MS 分析的總運(yùn)行時(shí)間從9.5 分鐘縮短至 6.5 分鐘。

表2 用于提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的二維液相色譜方法參數(shù)

結(jié)論

在藥代動(dòng)力學(xué)研究中將 2DLC/MS/MS 技術(shù)用于藥物及其代謝物的應(yīng)用引入了第二維分離，因此可避免出現(xiàn)共洗脫，并消除上述復(fù)雜樣品中的交叉干擾風(fēng)險(xiǎn)。從體外細(xì)胞懸液測(cè)定細(xì)胞上清液的分析中已經(jīng)證實(shí)了這種可能性。二維液相色譜卓越的分離能力實(shí)現(xiàn)了在 35分鐘的總運(yùn)行時(shí)間內(nèi)對(duì) 16 種目標(biāo)代謝物的分析，與采用六種不同方法對(duì)目標(biāo)代謝物進(jìn)行 1D-LC/MS/MS 分析的方法相比，這種方法能夠節(jié)省大量時(shí)間和樣品。

2D-LC/MS/MS 方法中第二維的使用成功提高了質(zhì)譜檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度。在該方法設(shè)置中，第一維采用能夠分離目標(biāo)分析物的條件，而在第二維中選擇有助于達(dá)到絕佳質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度的條件。以更適合的洗脫液將分析物引入質(zhì)譜離子源的方式大大提高了定量限。