肖作兵, 朱建才, 牛云蔚, 王品品, 孫小鑫, 王若琳

(1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院,上海 201418;2.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

自然界中存在成千上萬種不同的香氣成分,生物嗅覺系統(tǒng)可以識別這些香氣分子,以獲得對外界環(huán)境的直觀感覺聯(lián)系。香氣分子通過對嗅覺器官的刺激或者激活作用,產生了各種各樣的香氣。天然產物中香氣成分繁多,包含了酯類、醛類、內酯類、萜類、醇類、羰基以及含硫、含氮等化合物。這些香氣成分能客觀地反映天然產物的風味特點,是食品特性中與健康和營養(yǎng)關系最密切的品質。天然產物香氣的形成不是各個化合物氣味的簡單加和,而是由這些化合物相互作用最終形成的。由于不同香韻香氣成分之間關聯(lián)的復雜性和作用的多樣性,很難客觀、快速有效地確定香氣協(xié)調、天然逼真的天然產物香精組成與配方結構。目前只能借助于傳統(tǒng)調香師對香氣成分之間的感性經(jīng)驗,經(jīng)過不斷的實驗而得到優(yōu)化。因此,探究天然產物香氣成分及其不同香韻結構之間的協(xié)同作用機制等科學問題,已經(jīng)成為天然產物香精特征香氣調控技術能否從實驗室走向產業(yè)化、制約香精行業(yè)發(fā)展的關鍵瓶頸問題。本文從嗅覺產生機理、特征香氣形成理論和香氣成分間相互協(xié)同作用的研究方法等方面進行闡述。

1 嗅覺產生理論

嗅覺是人的本能反應,它同視覺、聽覺、觸覺一樣,構成了人類的基本感知能力。Buck和Axel兩位教授對嗅覺系統(tǒng)識別機制進行了大量深入的研究,發(fā)現(xiàn)了嗅覺受體基因超家族[1],大大推動了人們對嗅覺的認知水平。在香氣的感受過程中,香氣分子溶解在鼻粘液的水-脂質環(huán)境中,首先與綁定蛋白結合形成復合物,之后再與嗅覺受體特異性綁定,導致與之偶聯(lián)的G-蛋白活化并脫離。脫離的G-蛋白激活腺嘌呤環(huán)化酶,使得細胞內第二信使-cAMP增加,Ca2+等大量陽離子通過cAMP-門控通道涌進,進而產生動作電位。從而把香氣分子的化學信號轉換為電信號,并從神經(jīng)元直接傳遞到嗅球[2],從嗅球開始逐次傳遞,最終傳播到嗅覺皮層,實現(xiàn)嗅覺的感知[3]。由于他們的杰出貢獻,獲得了2004年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

2 特征香氣形成理論

雖然Buck和Axel教授揭示了嗅覺產生的機制,但是并沒有進一步闡明天然產物果香、花香等不同特征香氣形成的原因。針對這個問題,學者從香氣成分的形狀結構、官能團、立體構象、電子特性等方面為出發(fā)點,提出了重要的香氣形成理論,目前公認的理論主要有兩個,即分子振動理論和識別理論。其中識別理論包括形狀結構理論、立體結構理論和電子拓撲學理論。本節(jié)重點介紹了分子振動理論和識別理論中的立體結構理論和電子拓撲學理論。

2.1 分子振動理論

1996年,英國倫敦大學的Turin博士在總結舊理論的基礎上,以全新的觀點提出了新的分子振動理論[4]。該理論是基于非彈性電子隧道光譜(IEsT)發(fā)展起來的一種生物光譜理論,是振動光譜的非光學形式。該理論認為香氣分子與香氣接收器中蛋白質結合,可使香氣接收器處于激活或空置兩種狀態(tài),見圖1。

圖1 分子振動理論中香氣分子與氣味接收器作用Fig.1 Role of aroma molecules and odor receptors in molecular vibrational theory

由圖1可知,這兩種狀態(tài)之間具有一定的能量差。當香氣分子的振動能量等于上述的能量差時會被激活。氣味分子進入氣味接收器與之結合,使它失去一個電子。雙硫鍵斷開,G-蛋白產生嗅覺信號傳至大腦。谷胱甘肽還原酶的輔酶(NADPH)在此過程中充當可溶性電子捐贈器的作用。

雖然分子振動理論根據(jù)大量的實驗數(shù)據(jù),一定程度上闡述了各種香氣的產生,特別是有效解釋結構差異明顯,且具有類似香氣的問題。但依然存在幾個難以解釋的問題,如該理論并不能解釋各種香氣成分的強度,以及同一種香氣成分其香氣強度隨濃度變化的問題。

2.2 識別理論

2.2.1 立體結構理論

1971年,Amoore教授提出了香氣成分立體結構理論[5],該理論認為一種化合物的特殊香氣是由其分子形狀和大小來決定的,只有當香氣分子的立體結構能夠進入嗅覺器官中的氣味接收器內才能被感知,如圖2。該理論很好地解釋了一些具有相同官能團的分子立體結構相近的化合物香氣相近的問題。但是該理論很難解釋化學結構差異明顯而香氣接近的香氣成分。并且該理論同樣沒有解決不同濃度香氣成分呈現(xiàn)不同香氣和同一個人在不同心理狀態(tài)下會產生不同嗅覺香氣的問題。

圖2 立體結構理論中香氣分子與氣味接收器作用Fig 2 Role of aroma molecules and odor receptors in structure theory

2.2.2 電子拓撲學理論

電子拓撲學理論主要是以龍涎香成分為例子進行研究,提出了“龍涎三角”理論[6]。該理論是第一個將分子的電子特性和構象一起進行研究而提出來的電子拓撲理論,開拓了一種新的研究方法,具有一定的理論價值。從這個理論可以看出,化合物香氣可能與電子分布、構成分子的軌道等物理參數(shù),特別是最低空軌道和最高占有軌道有一定關系。

3 香氣成分間的協(xié)同作用研究方法

自然界中存在大量的香氣成分,通過對嗅覺器官的刺激或激活作用,產生了各種各樣的香氣。天然產物整體香氣不是各個香氣成分簡單的加和,而是通過復雜的協(xié)同作用最終形成。香氣成分之間的相互作用,總體上分為宏觀和微觀兩個層面。宏觀層面表現(xiàn)為香氣分子混合后化學或物理化學作用[7-8];微觀層面發(fā)生在鼻腔神經(jīng)末梢嗅覺受體感受器上[9-10],通過特定神經(jīng)元細胞的電生理作用,使來自不同受體的信號相互作用[11-12]。

3.1 宏觀層面協(xié)同作用研究方法

宏觀層面協(xié)同作用研究方法主要有4種,分別為閾值法、S型曲線法、OAV法和σ-τ圖,這些方法主要通過香氣成分組合前后的閾值、OAV、香韻強度值的變化,判定成分之間的協(xié)同作用。

3.1.1 閾值法

該方法按照各組分的閾值濃度進行混合,并通過三點選配法(3-AFC)進行閾值測定,最后將實際測定混合物閾值與理論計算得到的混合物閾值進行比較,從而判斷香氣協(xié)同程度[10,13]。通過閾值法研究表明,香氣成分之間的作用與成分的結構、香氣特征有一定關系。結構或香氣相似的香氣成分具有協(xié)同或加成作用,而結構或香氣不同的成分往往具有掩蔽作用或者無作用。2017年,本課題組對烏龍茶中24種香氣物質閾值濃度進行協(xié)同研究[13]。結果表明,2-甲基丁醛和3-甲基丁醛、反-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛等結構、香氣相似的成分具有協(xié)同或加成作用,而乙酸乙酯與乙酸、2-甲基丁醛與乙酸丁酯等結構或香氣差異明顯的成分具有掩蔽、抑制作用。2009年,Daan等[14]對啤酒中的26種陳化風味物質在閾值濃度下進行研究,得出了具有類似結構的不飽和烯醛之間有明顯的相加或者協(xié)同作用,而不同結構和香型的化合物之間,相互作用小的結論。閾值法需將香氣成分稀釋到閾值水平,只能研究閾值濃度下香氣成分之間的相互作用,并沒有考慮到濃度因素對相互作用影響。因此該方法對指導香精配方的設計方面具有局限性。

3.1.2 S型曲線法

該方法通過三點選配法測得A、B混合香氣成分10個系列濃度點下的正確檢測比例P,繪制濃度-P曲線,應用S型曲線y=1/(1+e-λx)進行擬合得到實驗值。定義P=0.5時,對應的橫坐標即為閾值。A、B混合后,通過Feller加合模型計算理論PAB,即PAB=PA+PB-PA×PB,繪制濃度-正確檢測比例PAB曲線,并進行擬合,計算理論值。若混合物實測閾值高于理論值,則發(fā)生掩蓋現(xiàn)象;若低于理論閾值,則發(fā)生協(xié)同作用,見圖3[15-19],圖中OT為閾值,R為相關系數(shù)。法國波爾多大學Lytra Georgia團隊在這方面做了大量的工作。他們采用S型曲線法對紅酒中香氣物質之間的相互作用進行了研究,發(fā)現(xiàn)亞閾濃度2-羥基-4-甲基戊酸乙酯[15]、(2S)-2-甲基丁酸乙酯[16]、二甲基三硫醚[17]能增強紅酒果香香韻強度,降低果香香韻的閾值,這些成分與果香香韻成分發(fā)生了協(xié)同作用;而添加5種實測濃度的高級醇于果香韻(13種乙酸酯類和乙酯類香氣物質)時,果香韻的強度值下降,閾值變大,即高級醇對果香韻具有抑制作用[20]。從上面的研究內容可以看出,S型曲線法綜合了香氣成分的閾值、濃度等因素的相互作用,彌補了閾值法的局限性。而采用數(shù)學擬合的方式計算閾值,使得閾值準確性大大提高。此外,該方法擴展了體系范圍,除研究二元體系,還可以研究香韻多元成分之間的相互作用,并以圖形形式直觀表現(xiàn)。因此,在研究香氣成分相互協(xié)同作用時,S型曲線法具有明顯的優(yōu)勢。

圖3 香氣成分協(xié)同作用S型曲線Fig.3 S-curve of synergistic effect of aroma compounds

3.1.3 OAV法

該方法通過混合物的實測OAV(odoractivity value)與理論OAV的比值來判斷混合物中組分間的相互作用[21-23]。其中混合物的實測OAV是混合物濃度與混合物實測閾值的比值;理論OAV值是混合物中各個組分的OAV值之和。該方法表明,香氣成分之間相互作用以加成為主,協(xié)同和掩蓋作用較少。Culleré等[23]采用OAV法研究9種重要的氧化醛類物質,研究發(fā)現(xiàn)這些化合物之間或者與其他香氣成分之間以加成作用為主。混合物中香氣成分的個數(shù)對相互作用也有影響,個數(shù)越多,則相互作用偏向于加成和掩蓋。Laska等[24]采用OAV法對三元混合物、六元混合物和十二元混合物體系進行研究,結果表明隨著混合物體系復雜度增加,混合物的理論與實驗OAV比值下降,香氣成分之間以掩蓋作用為主。Guadagni等[25]采用OAV法研究混合物體系中香氣成分作用關系,結果表明香氣成分之間一般都發(fā)生加成作用。和S型曲線法類似,OAV法同樣綜合了香氣成分的閾值、濃度等因素的相互作用,彌補了閾值法的局限性,適用于近閾值濃度香氣成分之間的作用。與S型曲線法相比,此方法測定的閾值,其準確性有所欠缺。

3.1.4 σ-τ 圖法

該方法是由Patte和Laffort[26]于1979年提出的σ=F(τ)模型,見圖4。τ是指A(或B)的香氣強度與兩者的香氣強度之和間的比值,其中τA=IA/(IA+IB)或者τB=IB/(IA+IB),σ代表混合物的香氣強度與各成分(在混合之前)的香氣強度之間的比值σ=Imix/(IA+IB),它反映相互作用程度。根據(jù)相互作用級別將該圖劃分為若干部分,實驗點的位置反映相互作用水平,當混合物的香氣強度與未混合之前各組分香氣強度之和相等時,則混合物處于完全加成作用(σ=1);當混合物香氣強度比其組成部分的總和更為強烈時,則為協(xié)同作用(σ＞1);當混合物的香氣強度比其各組成的總和要弱時,是折中或者掩蓋作用(σ＜1)[20,26-32]。σ-τ圖法以香氣成分強度值為考察指標,適用于近閾值或超閾值濃度下香氣成分之間的相互作用。該方法綜合考慮σ、τ值,并以圖形形式直觀展示,更加全面揭示了香氣成分相互作用。

圖4 香氣成分協(xié)同作用σ-τ圖Fig 4 σ-τ picture of synergistic effect of aroma compounds

該方法表明,香氣成分之間的相互協(xié)同作用與濃度有關。低濃度或者中等濃度時,香氣成分之間更容易表現(xiàn)為協(xié)同或者加成作用;高濃度時,香氣成分之間往往具有掩蓋、抑制作用。Cameleyre等[20]采用σ-τ圖的方法,研究了葡萄酒中5種高級醇對13種酯類化合物重組溶液香氣的影響。實驗結果表明,不同濃度高級醇對重組溶液的協(xié)同作用存在明顯的差異,濃度適中時表現(xiàn)協(xié)同作用,而濃度高時表現(xiàn)為掩蓋作用。因此,香氣成分之間相互作用的強弱與濃度有關。Ferreira[21-22]采用σ-τ圖法總結之前文獻報道的520對混合物數(shù)據(jù),結果表明在超閾值水平下,混合物香氣強度與組分香氣強度之和的比值基本小于1,即表現(xiàn)為掩蓋作用。Lytra等[28]研究紅酒中香氣物質之間的相互協(xié)同作用,結果表明高濃度下,二乙酰、乙偶姻、乙酸和γ-丁內酯對紅酒果香韻具有掩蓋作用。

3.2 微觀層面協(xié)同作用研究方法

Buck和Axel的研究表明[33-34],嗅覺系統(tǒng)能識別和分辨大量不同的氣味分子,起始于嗅神經(jīng)元纖毛上的嗅覺受體與氣味分子的相互作用。香氣的識別可以是一個或者多個嗅覺受體作用的結果。嗅覺受體具有一定數(shù)量的活性位點[35-37]。因此,香氣物質須采用競爭或者非競爭方式占據(jù)作用位點。而不同香氣成分與受體活性位點的結合能力存在差異。當不同香氣成分之間存在競爭活性位點時,往往表現(xiàn)為掩蓋作用;不同香氣成分之間存在相互協(xié)作或者非競爭活性位點時,往往表現(xiàn)為協(xié)同作用。直接研究香氣物質與活性位點的作用比較困難,但是可以通過研究嗅神受體經(jīng)元對香氣物質刺激的響應特性[38-40],監(jiān)測細胞鈣離子和電生理變化等手段,間接研究香氣成分之間的相互作用。

香氣成分之間的相互作用模式與成分濃度有關。低濃度或者中等濃度時,香氣成分之間更容易表現(xiàn)為協(xié)同或者加成作用;高濃度時,香氣成分之間往往具有掩蓋、抑制作用。El Mountassir等[27]采用神經(jīng)元鈣離子成像技術,研究不同濃度單一和混合香氣成分(辛醛、3-甲硫基丙醛、香茅醛)對4種嗅覺受體蛋白(OR1G1、OR52D1、OR1A1、OR2W1)的激活效果,監(jiān)測鈣離子的濃度變化,計算刺激條件下細胞的響應個數(shù),并以σ-τ圖形式判定香氣成分之間相互作用。結果表明,含有4種受體蛋白的細胞對辛醛與高濃度香茅醛混合的刺激,鈣離子濃度發(fā)生改變,且細胞響應個數(shù)低于單個成分刺激反應的總和,即發(fā)生了掩蓋或加成作用。Chaput等[41]研究紅酒中乙酸異戊酯和威士忌內酯與OR1G1受體相互作用。相比乙酸異戊酯單一成分,加入高濃度的威士忌內酯時,OR1G1神經(jīng)元活性明顯減弱,即乙酸異戊酯和威士忌內酯發(fā)生了掩蓋作用;而低濃度時,乙酸異戊酯和威士忌內酯發(fā)生了協(xié)同作用。Duchamp-Viret等[42]以小白鼠為研究對象,考察甲位突厥酮、鈴蘭醛、新鈴蘭醛等香氣成分嗅覺刺激下神經(jīng)元的電生理反應,并繪制濃度與神經(jīng)元響應曲線。結果表明,甲位突厥酮和鈴蘭醛的混合體系在閾值濃度和中等濃度條件下,響應曲線的斜率大于甲位突厥酮、鈴蘭醛單一成分斜率,故呈現(xiàn)為協(xié)同作用。

當不同香氣成分相互協(xié)作或者互不干擾占據(jù)位點時,更容易發(fā)生協(xié)同作用;不同香氣成分相互競爭活性位點時,更容易發(fā)生掩蓋作用。而當神經(jīng)元去極化作用達到最大化、受體蛋白飽和時,香氣成分之間協(xié)同作用向加成或者掩蓋作用轉化。這就解釋了香氣成分在低濃度下為協(xié)同作用,高濃度下為加成或掩蓋作用。

4 問題與展望

本文從嗅覺產生機理、特征香氣形成理論和香氣協(xié)同方法等方面進行闡述,重點介紹了宏觀和微觀兩方面對香氣協(xié)同方法。香氣、嗅覺是一個極其復雜的問題,集化學、物理學、生理學和心理學等多門學科知識為一體。雖然科研人員對嗅覺受體基因的組成結構、香氣形成、香氣協(xié)同等方面的研究已經(jīng)取得了較大的進展,但還有很多問題需要進一步深入研究才能解決。

1)香氣成分閾值差異問題。不同的香氣成分閾值存在差異,如醇類、酸類成分的閾值明顯大于酯類、含硫香氣成分,故酯類、含硫成分更容易被人體所感受,造成這個差異的原因至今未能有效解釋。2)在不同心理狀態(tài)下,人們對同個香氣成分有不同的香氣描述。按照現(xiàn)有理論,香氣的產生是主客體(成分與人體器官)之間相互作用的結果,香氣成分與受體蛋白的結合方式、位點相對固定,因此人體對香氣成分的描述也應不變。但是,人們在不同時間、心理狀態(tài)下,對香氣成分的香氣特征描述往往存在著差異。針對這個問題,目前還沒有有效的解釋。3)香氣協(xié)同作用的基質問題。天然產物香氣成分組成復雜,這些香氣成分之間存在著復雜的協(xié)同作用,并形成了特定的香氣。而研究者簡單地以兩種香氣成分為研究對象,考察了不同濃度、配比條件下的閾值變化、對香韻強度的影響,進而闡明兩者之間的可能存在的協(xié)同作用。但選取的這些體系偏理想化,并沒有考慮到不同基質體系對協(xié)同作用的影響。4)香氣協(xié)同作用研究方法單一。目前香氣協(xié)同方面的研究,大多采用某種單一的方法進行,僅通過簡單的添加或遺漏來表明香氣成分之間是否具有協(xié)同或掩蓋效果,沒有形成系統(tǒng)的研究方法,并且沒有綜合考慮各個方法的優(yōu)缺點和適用范圍。

本文通過綜述香氣產生及形成機理、香氣物質間的相互作用方法,研究天然產物香氣成分以及香韻結構之間的協(xié)同作用規(guī)律。目前香氣協(xié)同方面的研究更多專注于理論層面,并沒有涉及實際應用價值。只有將兩者結合起來,通過香氣協(xié)同作用機制指導設計出天然逼真的水果等香精產品,在實際應用中驗證香氣協(xié)同作用機制的準確性,實現(xiàn)天然產物特征香氣有效調控,為快速、合理構建香精體系提供理論指導。