鄧 穎 史偉浩 童進(jìn)東 王鐵平 喬正東 余 波

(1復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院血管外科,3科創(chuàng)中心 上海 201399; 2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

血管內(nèi)膜增生是血管重建術(shù)(如球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)、支架植入術(shù)、血管移植等)后常見(jiàn)且嚴(yán)重的并發(fā)癥之一,常導(dǎo)致手術(shù)失敗。探索有效抑制血管內(nèi)膜增生的方法是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是一種綠茶提取物,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)EGCG的作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,結(jié)果顯示EGCG具有抗炎癥反應(yīng)、抗血管動(dòng)脈粥樣硬化以及有效抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖等作用[1]。Lee等[2]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能強(qiáng)有效地抑制血小板源性生長(zhǎng)因子-BB (platelet-derived growth factor BB,PDGF-BB)刺激誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的有絲分裂。Orozco-Sevilla等[3]研究發(fā)現(xiàn)EGCG可以有效地阻止大鼠頸動(dòng)脈損傷后的內(nèi)膜增生。然而,對(duì)于EGCG抑制VSMC增殖和遷移的具體機(jī)制目前尚不明確。本研究擬觀(guān)察EGCG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移的影響,并探索其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

試劑與儀器DAPI(上海碧云天公司),多聚甲醛(國(guó)藥集團(tuán)),胰蛋白酶、FBS、3%戊巴比妥鈉、DMEM(美國(guó)Gibco公司),青霉素-鏈霉素溶液(美國(guó)Sigma公司),α-球蛋白單克隆抗體(美國(guó)Dako Cytomation公司),山羊抗鼠IgG (美國(guó)Protein Tech Group公司),光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica公司),SD大鼠(上海斯萊克動(dòng)物公司),RTCAxCELLigence細(xì)胞功能分析儀DP系統(tǒng),增殖實(shí)驗(yàn)板E-Plate16,遷移實(shí)驗(yàn)板CIM,CIM板夾具,37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Eppendorf公司),PDGF-BB(以色列ProSpec-Tany TechnoGene公司),EGCG(美國(guó)ApexBio公司),α-氰基-(3,4-羥基)N-芐苯乙烯胺(AG490,美國(guó)Med Chem Express公司),Western blot及IP細(xì)胞裂解液(上海威奧生物科技有限公司)?？贵wJak2,Stat3,P- Stat3,Cyclin D1及二抗,HRP抗體(美國(guó)CST公司),ECL顯影液(美國(guó)Advansta公司),Omega Lum G凝膠成像系統(tǒng)(Omega Lum G,美國(guó)Aplegen公司)。

大鼠胸主動(dòng)脈原代VSMC的提取與鑒定選取80～100 g雄性SD大鼠(清潔級(jí)),貼塊法分離培養(yǎng)胸主動(dòng)脈中膜VSMC于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長(zhǎng)后,用0.25%胰蛋白酶消化傳代,傳至3代進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色鑒定。

檢測(cè)EGCG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC增殖的影響于實(shí)驗(yàn)前1天饑餓細(xì)胞12 h,設(shè)置對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組:對(duì)照組,PDGF-BB 10ng/mL,PDGF-BB 10 ng/mL+EGCG 10 μmol/L,PDGF-BB 10ng/mL+EGCG 50 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL+EGCG 100 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL+AG490 50 μmol/L。向E-Plate16的孔中加入50 μL各組溶液,將增殖板E-Plate16放置于細(xì)胞功能分析儀(RTCA)自動(dòng)掃描,檢測(cè)接觸是否良好;開(kāi)始檢測(cè)基線(xiàn),確定所選擇的孔接觸正常,所有孔的Cell Index低于0.063為正常。取出E-Plate16,每孔中加入100 μL混合均勻的VSMC懸液,使每孔中細(xì)胞數(shù)目每100 μL含5 000個(gè)細(xì)胞。將E-Plate16置于超凈臺(tái)中室溫放置30 min,放入培養(yǎng)箱中。在系統(tǒng)自動(dòng)掃描后,開(kāi)始檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組VSMC增殖曲線(xiàn)。

檢測(cè)EGCG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC遷移的影響實(shí)驗(yàn)前1天饑餓細(xì)胞12 h,對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組設(shè)置同前。CIM板下室的孔中加入165 μL各組PDGF-BB液體后,裝配CIM板上室,在上室的孔中加入30 μL無(wú)血清培養(yǎng)基。將裝配好的CIM板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中平衡1 h。檢測(cè)接觸是否良好,開(kāi)始進(jìn)行基線(xiàn)檢測(cè),所有孔的Cell Index低于0.063為正常。在上室的孔中加入100 μL混合均勻的VSMC懸液,使每孔中細(xì)胞數(shù)目為100 μL含5 000個(gè)細(xì)胞;置于超凈臺(tái)室溫放置30 min,上機(jī)檢測(cè)。

細(xì)胞總蛋白提取和Westernblot檢測(cè)根據(jù)增殖及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)置實(shí)驗(yàn)組為:對(duì)照組(-),PDGF-BB 10 ng/mL,PDGF-BB 10 ng/mL +EGCG 50 μmol/L,PDGF-BB 10 ng/mL +AG490 50 μmol/L。其中對(duì)照組(-)和PDGF-BB 10 ng/mL+AG490 50 μmol/L實(shí)驗(yàn)組干預(yù)時(shí)間為12 h,其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組干預(yù)時(shí)間為12 h和24 h。Western blot及IP細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞,并加入PMSF,使其最終濃度為1 μmol/L。4 ℃條件下,轉(zhuǎn)速13×g,離心10 min后,取上清液。BCA法檢測(cè)蛋白濃度。取15 μL蛋白質(zhì)樣品上樣,進(jìn)行SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入對(duì)應(yīng)一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST清洗3次,1次10 min,加入二抗于室溫下孵育2 h,TBST清洗3次,ECL顯影液在凝膠成像系統(tǒng)顯影。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析,每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上,各組間結(jié)果采用One-way ANOVA進(jìn)行比較,以α=0.05 為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

大鼠胸主動(dòng)脈原代VSMC鑒定細(xì)胞免疫化學(xué)染色后,顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量與細(xì)胞長(zhǎng)軸平行的纖維細(xì)絲,顏色為棕黃色,即為平滑肌 α肌動(dòng)蛋白絲,且核形態(tài)卵圓形位置居中(圖1)。96%的VSMC肌動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性。免疫組化結(jié)果證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC且純度高,符合本次實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞條件。

圖1 大鼠胸主動(dòng)脈原代VSMC中α肌動(dòng)蛋白的免疫化學(xué)染色(×200)Fig 1 Immunohistochemistry staining of α-SMA expression in primary VSMCs of thoracic aorta in rats (×200)

EGCG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC增殖的影響xCELLigence RTCA細(xì)胞功能分析儀DP系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2):實(shí)驗(yàn)中各濃度EGCG持續(xù)干預(yù)12 h及24 h均能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖(P<0.001);且50 μmol/L EGCG的抑制能力強(qiáng)于其他兩個(gè)濃度組(P<0.001);Jak2特異性抑制劑AG490明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖(P<0.001);50 μmol/L EGCG的抑制能力強(qiáng)于AG490 (P<0.001)。

The cell index of EGCG and AG490 on the proliferation activity of VSMCs induced by PDGF-BB.The Cell Index was assessed with RCTA assay at 12 and 24 h after using EGCG and AG490.(1)P<0.001.

圖2EGCG和AG490干預(yù)后PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖能力下降
Fig2TheabilityofVSMCsproliferationinducedbyPDGF-BBwasdescendedafterthetreatmentofEGCGandAG490

EGCG對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)VSMC遷移的影響xCELLigence RTCA細(xì)胞功能分析儀DP系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3):實(shí)驗(yàn)中各濃度EGCG持續(xù)干預(yù)12 h及16 h均能抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC遷移(P<0.001);且50 μmol/L EGCG的抑制能力強(qiáng)于其他兩個(gè)濃度組(P<0.001);Jak2特異性抑制劑AG490明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC遷移(P<0.001);50 μmol/L EGCG的抑制能力強(qiáng)于AG490 (P<0.001)。

The cell index of EGCG and AG490 on the migration activity of VSMCs induced by PDGF-BB.The cell index was assessed with RCTA assay at 12 and 16 h after using EGCG and AG490.(1)P<0.001.

圖3EGCG和AG490干預(yù)后PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC遷移能力下降
Fig3TheabilityofVSMCsmigrationinducedbyPDGF-BBwasdescendedafterthetreatmentofEGCGandAG490

EGCG及AG490干預(yù)后細(xì)胞蛋白質(zhì)水平Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:50 μmol/L EGCG的干預(yù)12 h及24 h后均能明顯下調(diào)PDGF-BB誘導(dǎo)后VSMC的Jak2蛋白質(zhì)水平(圖4B,P<0.001);且EGCG干預(yù)12 h較干預(yù)24 h的作用更為明顯(圖4B,P<0.01);AG490能明顯下調(diào)VSMC的Jak2蛋白質(zhì)水平(圖4B,P<0.001)。EGCG干預(yù)12 h能明顯下調(diào)PDGF-BB誘導(dǎo)后VSMC的Stat3蛋白質(zhì)水平(P<0.001),且AG490能明顯下調(diào)VSMC的Stat3蛋白質(zhì)水平(圖4C,P<0.001)。EGCG干預(yù)12 h及24 h后均能抑制VSMC的Stat3磷酸化水平,AG490能抑制VSMC的Stat3磷酸化水平(圖4D,P<0.001)。EGCG干預(yù)12 h及24 h后均能明顯下調(diào)PDGF-BB誘導(dǎo)后VSMC的Cyclin D1蛋白質(zhì)水平(P<0.001),而AG490也能下調(diào)VSMC的Cyclin D1蛋白質(zhì)水平,且EGCG下調(diào)VSMC的Cyclin D1蛋白質(zhì)水平較AG490更為明顯(圖4E,P<0.001)。

討 論

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病已成為目前主要的死亡原因和致殘?jiān)?也是心腦血管醫(yī)學(xué)面臨的長(zhǎng)期而嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。目前,對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化性疾病治療措施有開(kāi)放手術(shù)治療(如頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)、下肢血管自體及人工血管旁路移植術(shù)等)和微創(chuàng)治療,即血管腔內(nèi)介入治療(如頸動(dòng)脈支架植入術(shù)、冠脈球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)、冠脈支架植入術(shù)、下肢動(dòng)脈球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)及下肢血管支架植入術(shù)等),而術(shù)后血管內(nèi)膜增生所致的血管再狹窄是影響手術(shù)遠(yuǎn)期通暢率的主要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道在旁路移植術(shù)后1年內(nèi)再狹窄或閉塞的發(fā)生率達(dá)30%～40%[4-5],而球囊擴(kuò)張術(shù)后1年內(nèi)再狹窄的發(fā)生率高達(dá)55.8%[6-7]。目前研究認(rèn)為正常血管內(nèi)膜損傷后VSMC增殖及遷移所致的內(nèi)膜增生是血管再狹窄的主要原因,新生內(nèi)膜的過(guò)程涉及一系列復(fù)雜的信號(hào)通路和生物效應(yīng),如炎癥、血栓形成、VSMC增殖遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等[8-11]。

EGCG是一種綠茶提取物,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)EGCG的作用機(jī)制進(jìn)行了大量的研究,結(jié)果顯示EGCG具有抗炎癥反應(yīng)、抗血管動(dòng)脈粥樣硬化以及強(qiáng)有效的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和增殖等作用,而這些作用可能涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,包括Jak/Stat、Mapk、PI3K/AKT等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[1,12]。而在血管內(nèi)膜增生的過(guò)程中,Jak/Stat信號(hào)通路有重要的作用,有研究表明Jak2/Sak3參與調(diào)控大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后的VSMC增殖過(guò)程,而Jak2特異性抑制劑AG490能有效地抑制Stat3的磷酸化水平,從而抑制VSMC的增殖以及內(nèi)膜增生[13]。本研究中以PDGF-BB作為誘導(dǎo)劑刺激VSMC后,明顯上調(diào)了Jak2、Stat3蛋白質(zhì)水平以及Stat3磷酸化水平,而Jak2/Stat3信號(hào)通路下游的Cyclin D1蛋白質(zhì)水平也明顯上調(diào),而加入AG490后上述蛋白質(zhì)水平明顯被抑制,當(dāng)利用EGCG干預(yù)后上述蛋白質(zhì)水平也明顯下調(diào),且EGCG對(duì)于Jak2、Stat3蛋白質(zhì)水平以及Stat3磷酸化的下調(diào)與Jak2特異性抑制劑AG490相比較無(wú)明顯差異。EGCG對(duì)于Cyclin D1蛋白質(zhì)水平的下調(diào)作用要強(qiáng)于AG490,其主要原因可能為EGCG同時(shí)抑制了其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,具體機(jī)制需進(jìn)一步深入研究。Orozco-Sevilla等[3]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生,本次研究結(jié)果與其一致,并提示機(jī)制可能是通過(guò)抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路從而抑制VSMC增殖和遷移。

A:Western blot assay was performed to detect the protein expression of Jak2,Stat3,p-Stat3 and Cyclin D1 in VSMCs after the treatment of EGCG and AG490 and β-actin was used as an internal reference.B-E:Expression of protein Jak2,Stat3,p-Stat3 and Cyclin D1 (fold to control).(1)P<0.01.(2)P<0.001.

圖4EGCG和AG490干預(yù)后VSMC的Jak2,Stat3,Cyclin蛋白質(zhì)表達(dá)以及Stat3蛋白質(zhì)的磷酸化水平
Fig4TheproteinexpressionsofJak2,Stat3,CyclinD1andp-Stat3,proteinsinVSMCaftertreatmentwithEGCGandAG490

目前,針對(duì)抑制血管內(nèi)膜增生進(jìn)行了大量的研究,如藥物涂層支架的應(yīng)用在一定程度上抑制了血管內(nèi)膜增生,但是同時(shí)也延緩了血管內(nèi)皮的修復(fù),增加了遲發(fā)性血栓形成的可能性[14-15]。而EGCG作為一種植物提取物,安全性高,de la Torre等[16]利用EGCG加上認(rèn)知訓(xùn)練治療青少年唐氏綜合征,證明其安全有效。因此,深入研究EGCG抑制血管內(nèi)膜增生的相關(guān)機(jī)制,將有助于為治療血管重建術(shù)后再狹窄提供新的方向。

綜上所述,本研究結(jié)果初步證明EGCG可能通過(guò)抑制Jak2/Stat3信號(hào)通路從而抑制VSMC細(xì)胞增殖和遷移。關(guān)于EGCG抑制血管內(nèi)膜增生的研究大多數(shù)還處于細(xì)胞水平和動(dòng)物水平,因此需要對(duì)其機(jī)制進(jìn)行深入研究,以期為將來(lái)的臨床應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。