周 行 劉超凡 魯靜浩 朱鷺冰 李 明

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院皮膚科 上海 200032)

纖維化是皮膚愈合的重要過程之一,與手術(shù)切口愈合、燒傷后修復(fù)等密切相關(guān)。但過度纖維化不僅影響美觀,也降低皮膚保護(hù)、分泌和調(diào)溫等功能[1]。成纖維細(xì)胞是纖維化過程的主要效應(yīng)細(xì)胞,不僅自身合成以Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ)為主的細(xì)胞外基質(zhì),還持續(xù)釋放結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)等促纖維化細(xì)胞因子,進(jìn)一步促進(jìn)膠原合成[2]。纖維化組織內(nèi)的缺氧環(huán)境可能通過促使成纖維細(xì)胞分裂增殖、誘發(fā)成纖維細(xì)胞自噬和啟動(dòng)血管生成等途徑導(dǎo)致過度纖維化和疤痕增生[3]。因此,調(diào)控低氧條件下成纖維細(xì)胞的功能將有助于抑制過度纖維化。

臨床上尚無抑制過度纖維化的有效藥物,2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol,2-ME)是人體內(nèi)雌二醇的天然代謝產(chǎn)物,與雌激素受體的親和力幾乎為零,無雌激素不良反應(yīng)[4]。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),2-ME能顯著抑制正常皮膚成纖維細(xì)胞的活化,減少膠原合成[5]。本研究進(jìn)一步模擬皮膚組織內(nèi)缺氧環(huán)境,應(yīng)用低氧培養(yǎng)誘發(fā)正常皮膚成纖維細(xì)胞活化,研究2-ME對活化成纖維細(xì)胞的自噬水平及纖維化的影響。

材 料 和 方 法

主要試劑與材料胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶(美國Gibco公司);二甲基亞砜(美國Sigma公司);Bafilomycin A1、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液(美國Millipore公司);2-ME(美國MCE公司);抗人Ⅰ型膠原、CTGF、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (LC3)B抗體(自噬標(biāo)志物,英國Abcam公司);抗人低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor 1 alpha,HIF-1α)抗體(美國R&D公司);抗人自噬降解標(biāo)志物P62抗體(美國CST公司);山羊抗兔或小鼠二抗、雞抗兔熒光二抗(美國Thermo Fish公司);熒光染料4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(美國Roche公司)。CO2恒溫培養(yǎng)箱和三相細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

原代細(xì)胞培養(yǎng)與傳代局麻下切取健康志愿者的前臂正常皮膚組織,采用組織塊培養(yǎng)法[6]進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。修剪去除皮下組織后,將皮膚剪成1 mm3左右碎塊,均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi),加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。組織塊邊緣可見梭形細(xì)胞爬出并呈貼壁生長,待梭形細(xì)胞長至80%匯合時(shí),以含0.25%胰蛋白酶的平衡液消化細(xì)胞并傳代,實(shí)驗(yàn)選用第3～6代細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),志愿者知情同意。

細(xì)胞低氧培養(yǎng)和藥物干預(yù)將上述成纖維細(xì)胞置于CO2恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃,21% O2,5% CO2)中進(jìn)行常氧培養(yǎng)或在三相培養(yǎng)箱中(37 ℃,1% O2,5% CO2)進(jìn)行低氧培養(yǎng)。Bafilomycin A1和2-ME預(yù)先使用二甲基亞砜稀釋至16μmol/L和30 mmol/L儲(chǔ)存,使用前用細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋為干預(yù)濃度。

Westernblot使用含苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞后提取總蛋白。經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,依次加入一抗Ⅰ型膠原、CTGF、LC3B、HIF-1α、自噬降解標(biāo)志物P62、內(nèi)參β-actin及山羊抗兔或小鼠二抗,ECL顯影液顯影。圖像使用Image J軟件(由美國國立衛(wèi)生研究院開發(fā))分析,其中LC3B的圖像分析采用文獻(xiàn)[7]推薦的方法進(jìn)行。

免疫熒光成纖維細(xì)胞接種在35 mm共聚焦培養(yǎng)皿中,常氧或低氧培養(yǎng)24 h后,以4%多聚甲醛固定10 min,0.1%Triton ×100破膜30 min,5%FBS封閉30 min,加入LC3B一抗置于4 ℃冰箱過夜,再加入雞抗兔熒光二抗,室溫孵育2 h,加入熒光染料后,在熒光倒置顯微鏡下觀察拍照,采用Image J軟件進(jìn)行分析。

結(jié) 果

低氧對人皮膚成纖維細(xì)胞的纖維化和自噬相關(guān)蛋白質(zhì)水平的影響成纖維細(xì)胞在低氧培養(yǎng)0、6、12、24 h后,HIF-1α水平隨低氧時(shí)間延長而升高,提示低氧模型成功建立。隨著低氧時(shí)間的延長,Ⅰ型膠原和CTGF蛋白質(zhì)水平不斷增加,在低氧24 h時(shí)Ⅰ型膠原和CTGF水平較低氧0 h顯著升高(P<0.05,圖1A),呈時(shí)間依賴性。自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ水平隨著低氧時(shí)間的延長而逐漸升高,而自噬降解標(biāo)志物P62水平隨著低氧時(shí)間的延長而逐漸減低,在低氧24 h時(shí)LC3Ⅱ水平顯著升高,P62水平顯著降低(P<0.05,圖1B),呈時(shí)間依賴性。與常氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞相比,低氧培養(yǎng)24 h后成纖維細(xì)胞(圖2A)表達(dá)LC3熒光顯著增強(qiáng)(P<0.05,圖2B)。

Hypoxia groupvs.normoxia group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖1低氧條件下皮膚成纖維細(xì)胞的纖維化(A)和自噬相關(guān)蛋白(B)的水平
Fig1Fibrosis(A)andautophagy-relatedproteins(B)expressionofdermalfibroblastsafterexposuretohypoxia

BafilomycinA1對低氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞纖維化和自噬相關(guān)蛋白的影響使用不同濃度自噬抑制劑Bafilomycin A1(0、5、10、50 nmol/L)干預(yù)并予低氧培養(yǎng)24 h后,成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原、CTGF減少,且隨Bafilomycin A1濃度的升高,Ⅰ型膠原、CTGF水平降低,而HIF-1α和LC3Ⅱ、P62等自噬相關(guān)蛋白水平增多。50 nmol/L的Bafilomycin A1干預(yù)組較未干預(yù)組的Ⅰ型膠原和CTGF水平顯著降低(P<0.05,圖3),LC3免疫熒光表達(dá)(圖2C)較未干預(yù)組(圖2B)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。

2-ME對低氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞纖維化和自噬水平的影響使用不同濃度2-ME(0、5、10、25μmol/L)干預(yù)后,低氧培養(yǎng)24 h成纖維細(xì)胞的HIF-1α、Ⅰ型膠原和CTGF水平下降,且隨2-ME濃度的升高,HIF-1α、I型膠原和CTGF水平不斷下降,自噬相關(guān)分子LC3Ⅱ水平下降,而P62水平升高,均呈濃度依賴性。25μmol/L 2-ME處理組與未干預(yù)組相比,HIF-1α、I型膠原和CTGF水平顯著降低(P<0.05,圖4)。25μmol/L 2-ME干預(yù)后,低氧培養(yǎng)24 h的成纖維細(xì)胞LC3免疫熒光水平(圖2D)較未干預(yù)組(圖2B)顯著減弱(P<0.05)。

討 論

正常的皮膚組織纖維化有助于手術(shù)或各種創(chuàng)傷后的皮膚缺損愈合,但過度纖維化會(huì)造成皮膚組織強(qiáng)度下降、功能缺失和外觀缺陷。目前認(rèn)為皮膚組織纖維化后缺氧可能是進(jìn)一步加重皮膚纖維化、形成疤痕增生的重要因素。HIF-1α活化促使成纖維細(xì)胞分裂增殖被認(rèn)為是低氧誘發(fā)纖維化的重要機(jī)制之一[8]。Hong等[9]進(jìn)一步研究認(rèn)為,在低氧情況下,HIF-1α可能通過上調(diào)CTGF mRNA介導(dǎo)成纖維細(xì)胞膠原合成增加。本研究結(jié)果也提示,隨著低氧時(shí)間的延長,HIF-1α的水平增多,成纖維細(xì)胞表達(dá)CTGF和合成Ⅰ型膠原也隨之增多,這證實(shí)了低氧可導(dǎo)致成纖維細(xì)胞活化繼而引起纖維化。纖維化使血管與組織細(xì)胞的間距增加,進(jìn)一步加劇缺氧,形成缺氧與纖維化的惡性循環(huán)。

A:Normoxia (21%O2);B:Hypoxia (1%O2);C:50 nmol/L Bafilomycin A1+hypoxia (1%O2);D:25μmol/L 2-ME+hypoxia (1%O2).

圖2BafilomycinA1和2-ME干預(yù)組皮膚成纖維細(xì)胞低氧培養(yǎng)24h后LC3的水平
Fig2EffectofBafilomycinA1and2-MEonLC3expressionindermalfibroblastsafterexposuretohypoxiafor24h

Bafilomycin A1 treatment groupvs.control group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖3BafilomycinA1干預(yù)組皮膚成纖維細(xì)胞低氧培養(yǎng)24h后纖維化和自噬相關(guān)蛋白的水平
Fig3EffectofBafilomycinA1onfibrosisandautophagyrelatedproteinsexpressionofdermalfibroblastafterexposuretohypoxiafor24h

2-ME treatment groupvs.control group,(1)P<0.05;(2)P<0.01.2-ME:2-methoxyestradiol;HIF-1α:Hypoxia-inducible factor-1α;CTGF:Connective tissue growth factor;LC3:Microtubule-associated protein 1 light chain 3.

圖42-ME干預(yù)組皮膚成纖維細(xì)胞低氧培養(yǎng)24h后纖維化和自噬相關(guān)蛋白的水平
Fig4Effectof2-MEonfibrosisandautophagy-relatedproteinsexpressionofdermalfibroblastafterexposuretohypoxiafor24h

低氧環(huán)境下的成纖維細(xì)胞自噬水平增高被認(rèn)為是低氧誘發(fā)纖維化的另一重要機(jī)制。自噬是細(xì)胞利用自身衰老或損傷的細(xì)胞器和代謝廢物,進(jìn)行物質(zhì)再循環(huán)的過程[10]。自噬加快促使活化的成纖維細(xì)胞過度合成大量膠原。為了探究低氧條件下成纖維細(xì)胞自噬水平和纖維化的關(guān)系,我們檢測了低氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的水平。

作為自噬的重要標(biāo)志分子,LC3在細(xì)胞內(nèi)有2種形式:LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。LC3Ⅰ經(jīng)過泛素化修飾后與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ,LC3Ⅱ是自噬小體形成的標(biāo)志。P62是自噬降解的標(biāo)志物,連接泛素化底物和LC3,最后P62和LC3Ⅱ在自噬溶酶體中一起被降解[11]。經(jīng)典的自噬抑制劑Bafilomycin A1可抑制自噬小體和溶酶體的結(jié)合,自噬小體無法被降解,LC3Ⅱ不斷蓄積,同時(shí)P62也因無法被降解而含量升高[12]。我們研究發(fā)現(xiàn),隨著低氧時(shí)間的延長,成纖維細(xì)胞表達(dá)LC3Ⅱ升高,表明低氧促進(jìn)了皮膚成纖維細(xì)胞的自噬。加用Bafilomycin A1干預(yù)細(xì)胞自噬后,低氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞過度合成的Ⅰ型膠原和CTGF明顯減少,這表明抑制自噬可以顯著阻斷成纖維細(xì)胞纖維化,有可能成為皮膚纖維化疾病的重要治療靶點(diǎn)。

2-ME是雌二醇的體內(nèi)代謝產(chǎn)物,失去其雌激素前體的性激素活性,同時(shí)具有顯著的細(xì)胞調(diào)節(jié)活性[4]。我們曾發(fā)現(xiàn)2-ME可以抑制皮膚成纖維細(xì)胞活化[5],還有研究發(fā)現(xiàn)它通過抑制HIF-1α增強(qiáng)瘢痕疙瘩放療的效果[13],但2-ME對成纖維細(xì)胞自噬水平的影響尚不清楚。本研究采用2-ME干預(yù)低氧培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)其表達(dá)HIF-1α、CTGF和Ⅰ型膠原下降,且隨2-ME濃度的增高,這種抑制作用越加顯著,表明2-ME可抑制低氧導(dǎo)致的成纖維細(xì)胞纖維化。同時(shí),在低氧條件下,2-ME處理的成纖維細(xì)胞LC3Ⅱ水平減低,LC3熒光減弱,P62水平增多,這提示2-ME可能通過抑制成纖維細(xì)胞自噬而阻斷低氧導(dǎo)致的纖維化,而且其對自噬作用的靶點(diǎn)很可能在經(jīng)典自噬抑制劑Bafilomycin A1自噬作用靶點(diǎn)的上游,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,低氧條件下皮膚成纖維細(xì)胞自噬水平增高并過度活化;2-ME可通過抑制低氧條件下成纖維細(xì)胞的自噬而阻斷纖維化,這為2-ME在皮膚纖維化疾病中的應(yīng)用提供了新的理論依據(jù)。2-ME因不良反應(yīng)小、不易產(chǎn)生耐藥性和口服耐受性好等優(yōu)點(diǎn)而具有很好的臨床應(yīng)用前景[14]。