林 晶 陳進(jìn)宏 魯 明

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科 上海 200040)

膽囊結(jié)石是消化系統(tǒng)的常見(jiàn)病,隨著生活方式和飲食結(jié)構(gòu)等的改變,其發(fā)病率呈較快的上升趨勢(shì),部分地區(qū)患病率已超過(guò)10%[1];同時(shí)以膽固醇(cholesterol,Ch)為主要成分的膽囊膽固醇結(jié)石已經(jīng)成為我國(guó)膽囊結(jié)石患者的主要發(fā)病類型。膽囊膽固醇結(jié)石是由肝臟分泌膽汁成分異常、膽道系統(tǒng)功能異常、環(huán)境及基因等多因素共同參與而形成,其中膽汁膽固醇過(guò)飽和被認(rèn)為是膽固醇結(jié)石形成的始發(fā)因素[2]。

肝臟分泌至膽汁中的膽固醇主要來(lái)源于肝臟攝取血循環(huán)中脂蛋白結(jié)合的膽固醇,僅少部分來(lái)源于自身合成的膽固醇及水解的膽固醇酯(cholesterol ester,ChE)[3]。位于肝細(xì)胞表面的清道夫受體B1(scavenger receptor class B1,SRB1)、低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor,LDLR)和LDLR相關(guān)蛋白(LDLR-related protein,LRP)可將脂蛋白所攜帶的Ch攝取入肝細(xì)胞[4-6]。許多研究表明LDLR在Ch代謝和Ch分泌中起重要作用,且與膽囊膽固醇結(jié)石的形成密切相關(guān)[7-8]。LDLR的表達(dá)水平受到轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩方面的調(diào)節(jié)。激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2 (sterol regulatory element binding,protein 2,SREBP2)可以誘導(dǎo)LDLR基因的轉(zhuǎn)錄,使其mRNA水平增加;同時(shí)激活SREBP2也能誘導(dǎo)前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)的表達(dá),PCSK9在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)LDLR蛋白質(zhì)水平[9-10]。

近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)了另外一種在蛋白質(zhì)降解水平調(diào)控LDLR的蛋白質(zhì)——誘導(dǎo)LDLR降解物(inducible degrader of the LDLR,IDOL)[11]。IDOL具有E3泛素連接酶活性,可通過(guò)不同于PCSK9的途徑降解LDLR,從而影響肝臟Ch代謝和Ch分泌。全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),IDOL基因上的一些單核苷酸多態(tài)性與Ch代謝相關(guān)[12-13]。IDOL在人類膽囊膽固醇結(jié)石中的作用未見(jiàn)報(bào)道,本文對(duì)膽囊膽固醇結(jié)石患者肝臟IDOL的表達(dá)進(jìn)行研究。

資 料 和 方 法

一般資料收集復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院普外科2015年6月至12月住院行腹部手術(shù)的21例膽囊膽固醇結(jié)石患者(cholesterol gallstone patients,GS)及14例行其他腹腔手術(shù)的非膽囊膽固醇結(jié)石患者(gallstone-free patients,GSF)的血清、膽汁及肝臟組織標(biāo)本。所有結(jié)石患者的結(jié)石均參照傅培彬法[14]和肉眼觀察證實(shí)Ch含量>65%;非膽囊結(jié)石患者經(jīng)B超證實(shí)膽囊無(wú)結(jié)石且偏光顯微鏡下膽汁無(wú)膽固醇結(jié)晶。所有入組患者排除糖尿病、高膽固醇血癥、肥胖、酒精濫用史及肝臟惡性腫瘤等可能影響肝臟功能的情況,同時(shí)無(wú)服用脂質(zhì)代謝藥物史。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者簽署知情同意書。比較兩組患者性別、年齡、體重指數(shù)(body mass index,BMI)和空腹血糖等一般資料,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1GS與GSF患者一般資料比較

VariableGS (n=21)GSF (n=14)PAge (y)56.29±10.4947.07±18.780.155(1)Gender (female/male)15/68/60.477(2)BMI (kg/m2)22.96±3.0322.27±3.880.555(3)Fasting glucose (mmol/L)5.22±0.924.81±0.550.248(1)

(1)Mann Whitney U test;(2)Fisher exact test;(3)Student’sttest.

生化檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書,采用酶法測(cè)定血清和膽汁的總Ch、總膽汁酸、三酰甘油(triglyceride,TG)及磷脂等指標(biāo)。Ch飽和指數(shù)(cholesterol saturation index,CSI)按照Ch、磷脂、膽汁酸含量,根據(jù)Carey量表[15]計(jì)算得到。

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)方法檢測(cè)肝臟組織相關(guān)基因mRNA水平。按照試劑盒說(shuō)明書從肝臟提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄(基因引物序列見(jiàn)表2)后行PCR反應(yīng),條件如下:95 ℃、15 min;95 ℃、15 s,60 ℃、20 s,72 ℃、30 s,共40個(gè)循環(huán);95 ℃、15 s,60 ℃、15 s,95 ℃、15 s。采用相對(duì)表達(dá)量法(2-△△CT法)[16]進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,內(nèi)參選用GAPDH基因。

表2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人基因引物序列Tab 2 Primer sequences for quantitative real-time PCR in human

免疫組化檢測(cè)運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)肝臟IDOL和LDLR蛋白質(zhì)水平。甲醛固定的石蠟塊切成3 mm切片,預(yù)處理和封閉后,抗IDOL抗體按1∶100稀釋、抗LDLR抗體按1∶300稀釋后4 ℃反應(yīng)過(guò)夜,洗滌后HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育60 min,DAB顯色液顯色8 min后蘇木精復(fù)染,酒精脫水、透明、封片。切片于100倍顯微鏡下觀察,并用CCD相機(jī)拍照,使用同樣的顯微鏡工作條件與相機(jī)工作條件一次完成所有照片,并將照片保存為TIFF格式。IDOL和LDLR蛋白質(zhì)存在于胞質(zhì)[19],使用Image-pro plus 6.0 軟件分析照片的區(qū)域光密度平均值(mean option density,MOD),代表蛋白質(zhì)的相對(duì)水平。

結(jié) 果

兩組患者血清和膽汁生化指標(biāo)比較GS組血清總Ch、血清TG、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白與GSF相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。GS組膽汁Ch含量和CSI明顯高于GSF組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01,表4)。而GS組膽汁中磷脂和總膽汁酸濃度與GSF組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

Variable (mmol/L)GS (n=21)GSF (n=14)PCholesterol4.26±0.723.80±0.650.060(1)Triglyceride 2.17±0.331.96±0.330.082(1)LDL-C 1.27±0.291.10±0.190.071(1)HDL-C 0.94±0.260.92±0.190.723(1)

(1)Student’sttest.

VariableGS (n=21)GSF (n=14)PCholesterol (mmol/L)13.12±1.358.88±0.83<0.001(1)Phospholipids (mmol/L)29.77±3.3231.75±2.660.070(1)Bile acid (mmol/L)161.48±31.34152.45±19.340.344(1)Cholesterol (mol%)6.57±1.314.63±0.49<0.001(2)Phospholipids (mol%)14.90±2.7316.58±1.930.144(2)Bile acid (mol%)78.53±3.7378.80±2.100.580(2)Total biliary lipids (g/dL)10.74±1.5410.29±1.040.342(1)CSI1.18±0.180.79±0.09<0.001(3)

(1)Student’sttest;(2)Mann Whitney U test;(3)Unpairedttest with Welch’s correction.

兩組患者肝臟相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平采用熒光定量PCR檢測(cè)肝臟Ch代謝相關(guān)基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn),GS組肝臟IDOL mRNA水平顯著低于GSF組(P<0.05,圖1)。兩組其他肝臟Ch代謝相關(guān)基因的mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。定量免疫組化分析發(fā)現(xiàn),GS組肝臟IDOL蛋白質(zhì)水平同樣低于GSF組(P<0.05,圖2A、2B),這與兩組患者IDOL mRNA水平結(jié)果相一致。而GS組肝臟LDLR蛋白質(zhì)水平則高于GSF組(P<0.05,圖2C、2D)。

Hepatic related genes mRNA levels in GS (n=21) and GSF (n=14) were analyzed by qRT-PCR.(1)P<0.05.

圖1兩組患者肝臟相關(guān)基因表達(dá)
Fig1ExpressionofhepaticrelatedgenesinGSandGSF

A:Semi-quantitative immunohistochemical analysis of hepatic IDOL protein in GS (n=21) and GSF (n=14);B:Hepatic specimens were immunohistochemically stained for IDOL (×100);C:Quantitative immunohistochemical analysis of hepatic LDLR protein in GS and GSF;D:Hepatic specimens were immunohistochemically stained for LDLR (×100).(1)P<0.05.

圖2兩組患者肝臟IDOL和LDLR蛋白質(zhì)水平
Fig2ProteinlevelsofhepaticIDOLandLDLRinGSandGSF

GS肝臟基因蛋白質(zhì)水平與膽汁生化指標(biāo)相關(guān)性分析GS肝臟IDOL蛋白質(zhì)水平與肝臟LDLR蛋白質(zhì)水平呈明顯負(fù)相關(guān)(圖3A)。GS肝臟LXRα mRNA水平與肝臟IDOL蛋白質(zhì)水平呈明顯正相關(guān)性(圖3B)。GS肝臟IDOL蛋白質(zhì)水平與膽汁Ch摩爾百分比及CSI的水平呈明顯負(fù)相關(guān)性(圖3C、3D)。

圖3 GS肝臟基因/蛋白質(zhì)與膽汁生化指標(biāo)相關(guān)性分析Fig 3 Correlation analysis of hepatic related genes/protein and biliary lipid composition in GS

討 論

膽囊膽固醇結(jié)石病因復(fù)雜,膽汁中Ch過(guò)飽和進(jìn)而析出Ch結(jié)晶是形成膽固醇結(jié)石的先決條件[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)GS膽汁Ch含量和CSI明顯高于GSF,這與以往許多報(bào)道一致[21-23]。由肝臟分泌至膽汁中的Ch主要來(lái)源于肝臟攝取血循環(huán)中脂蛋白結(jié)合的Ch[3]。Zanlungo等[8]報(bào)道小鼠喂養(yǎng)致石飼料后,肝臟分泌至膽汁中的Ch主要來(lái)源于由LDLR介導(dǎo)而攝取的Ch。LDLR是肝臟攝取血漿脂蛋白中Ch的重要介質(zhì)。Uppal等[7]發(fā)現(xiàn)33%野生型小鼠在喂養(yǎng)致石飼料3周后形成膽囊Ch結(jié)晶,而LDLR基因敲除小鼠在同樣條件下不形成膽囊Ch結(jié)晶;這提示在缺失LDLR情況下血漿Ch不能正常轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝細(xì)胞,肝臟分泌的膽汁中Ch含量下降,導(dǎo)致不易形成膽囊膽固醇結(jié)石。這些研究結(jié)果說(shuō)明LDLR在Ch代謝和膽汁Ch分泌中起重要作用。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一種具有E3泛素連接酶活性的IDOL可在蛋白質(zhì)水平降解LDLR。IDOL基因啟動(dòng)子區(qū)存在LXRα結(jié)合位點(diǎn),激活LXRα能上調(diào)IDOL表達(dá)[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)IDOL mRNA和蛋白質(zhì)水平在GS肝臟中均下降;相關(guān)性分析表明IDOL蛋白質(zhì)水平與膽汁Ch含量及CSI均呈明顯的負(fù)相關(guān)。這提示肝臟IDOL表達(dá)水平的下降提高了患者膽汁Ch含量及CSI。而且GS組肝臟LDLR蛋白質(zhì)水平高于GSF,同時(shí)GS組IDOL蛋白質(zhì)水平與LDLR蛋白質(zhì)水平也呈明顯負(fù)相關(guān),這提示IDOL可能通過(guò)LDLR來(lái)影響膽汁Ch濃度,進(jìn)而在膽囊膽固醇結(jié)石的形成中發(fā)揮作用。雖然GS組肝臟IDOL的表達(dá)量低于GSF組,但是兩組LXRα mRNA的水平未見(jiàn)明顯差異。這提示除LXRα外,可能還存在其他影響IDOL表達(dá)的途徑。

LDLR的表達(dá)除了受IDOL轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)外,還受SREBP2途徑調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ch水平下降時(shí),可激活SREBP2,在轉(zhuǎn)錄水平增加LDLR基因的表達(dá);但同時(shí)也增加PCSK9的表達(dá),PCSK9可在轉(zhuǎn)錄后水平降解LDLR[9-10]。我們的研究結(jié)果顯示,兩組患者肝臟SREBP2和PCSK9的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是因?yàn)楸狙芯繕颖玖枯^少,不能完全除外抽樣誤差。因此,SREBP2和PCSK9與LDLR的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,膽囊膽固醇結(jié)石的始發(fā)原因?yàn)榛颊吣懼蠧h含量過(guò)飽和。肝臟IDOL表達(dá)水平的下降與膽囊膽固醇結(jié)石的形成有關(guān),其作用機(jī)制可能是通過(guò)提高肝臟LDLR蛋白質(zhì)水平,增加肝臟Ch水平,進(jìn)而影響膽汁中的Ch含量。IDOL影響膽囊膽固醇結(jié)石形成的具體機(jī)制還有待深入研究。