王玉連 袁公 陳雅楠 曹永兵 吳建華

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院皮膚科，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

近年來，隨著廣譜抗生素的不合理應(yīng)用、激素的濫用、腫瘤的化學(xué)治療及器官移植后免疫抑制劑的大量應(yīng)用，導(dǎo)致真菌感染呈上升趨勢，其中白念珠菌導(dǎo)致的真菌感染最常見 (36%)[1]。氟康唑因其口服吸收效果好，生物利用度高，副作用小，在臨

床上廣泛使用。但由于其長期過度使用，目前白念珠菌對氟康唑的耐藥率逐漸增加，導(dǎo)致臨床治療真菌感染失敗。

利福噴丁為利福霉素類抗生素，是治療結(jié)核病的一線用藥，抗結(jié)核桿菌作用比利福平強(qiáng)2～10倍，且同等劑量下對患者胃腸道刺激及肝功能損傷均小于利福平[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)利福噴丁對氟康唑抗耐藥白念珠菌有增效作用[3]，為進(jìn)一步研究其增效作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測不同用藥組細(xì)胞內(nèi)DNA含量變化，觀察利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥對耐藥白念珠菌細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

主要儀器 5417R高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf FACSCalibur)；流式細(xì)胞儀 (美國BD公司)。

菌株 氟康唑耐藥白念珠菌100臨床分離株，由長海醫(yī)院真菌室提供，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心保存，經(jīng)形態(tài)學(xué)及生化學(xué)鑒定，氟康唑MIC80≥256 μg/mL，菌株實(shí)驗(yàn)前經(jīng)沙氏培養(yǎng)基 (SDA)劃板活化，30℃培養(yǎng)24～48 h，以保證受試真菌的活力與純度，并于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥物與試劑 利福噴丁 (美國melone公司，批號S0118A)，將利福噴丁用二甲基亞砜 (DMSO,Sigma公司)溶解為20 mg/mL，-20℃避光儲存?zhèn)溆?；氟康唑注射?(大扶康DIFLUCAN，輝瑞制藥有限公司，批號A075102，濃度2 mg/mL)，4℃儲存。碘化丙啶 (PI，Sigma產(chǎn)品)；RNAse (Sigma分裝) ；磷酸鹽緩沖液 (Phosphate Buffered Saline，PBS)：氯化鈉 (NaCl)8 g，氯化鉀 (KCl)0.2 g，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4)0.133 g，磷酸二氫鉀 (KH2PO4)0.06 g，碳酸氫鈉 (NaHCO3)0.35 g，調(diào)整pH值為7.2，定容至1 000 mL，然后高壓蒸汽滅菌，置于4℃冰箱保存。

培養(yǎng)基 SDA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加三蒸水900 mL溶解，加入2 mg/mL氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，高壓滅菌，4℃保存。RPMI 1640培養(yǎng)液：RPMI 1640粉末10 g，NaHCO32.0 g，三氮嗎啡啉丙磺酸鈉 (MOPS，Sigma)34.5 g，加三蒸水900 mL溶解，1 moL/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0±0.1 (25℃)，定容至1 000 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后于4℃保存。

1.2 方法

含藥RPMI 1640培養(yǎng)液的配制 利福噴?。菏紫葘⒗姸∮枚谆鶃嗧咳芙鉃?0 mg/mL藥物原液，然后用RPMI 1640培養(yǎng)液將上述藥物原液稀釋至利福噴丁濃度為250 μg/mL (2倍工作濃度)。氟康唑：將濃度為2 mg/mL氟康唑注射液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋至氟康唑濃度8 μg/mL (2倍工作濃度)。利福噴丁+氟康唑聯(lián)：取一定量的RPMI 1640培養(yǎng)液，分別加入20 mg/mL利福噴丁原液和2 mg/mL氟康唑注射液，配制成利福噴丁/氟康唑濃度為250/8 μg/mL (2倍工作濃度)。

白念珠菌的復(fù)蘇和菌懸液的配制 用接種環(huán)挑取SDA培養(yǎng)基上的單克隆菌落，接種到1 mL YEPD培養(yǎng)液中，于30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，活化24 h，使真菌處于指數(shù)生長期后期。取菌液10 μL再次接種到Y(jié)EPD培養(yǎng)液1 mL中活化16 h，經(jīng)3 000×g離心5 min，去上清液，取1 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃為 (3～5)×106cell/mL (2倍工作濃度)。分別取配制好的藥物培養(yǎng)液500 μL加入新鮮配制的菌懸液500 μL于玻璃試管中，使利福噴丁的終濃度為125 μg/mL，氟康唑終濃度為4 μg/mL、合藥組 (利福噴丁/氟康唑)終濃度為125/4 μg/mL，同時取RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL加入菌懸液500 μL作為生長對照組。將各組樣本放入30℃，200 r/min恒溫振蕩箱避光條件下分別培養(yǎng)24 h。每組平行做3個樣本。

固定、DNA染色、流式細(xì)胞儀檢測 將培養(yǎng)12 h的菌懸液移至1.5 mL的EP管中，5 000×g離心5 min，去上清液，加PBS重懸洗滌2次，加入預(yù)冷的70%無水乙醇放置于4℃冰箱，72 h后取出，加PBS洗滌，離心，用PBS重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106左右，取上述菌懸液400 μL，加入20 μL的RNAse (10 mg/mL)，使其工作濃度為500 μg/mL，充分混勻后于37℃水浴1 h，除去RNA，然后各組樣品中加入20 μL PI溶液 (1 mg/mL)染色，使其工作濃度為50 μg/mL，常溫避光條件下靜置30 min后，將各樣品分別移入進(jìn)樣試管中, 每個樣品獲取2 000個細(xì)胞，F(xiàn)L2檢測通道，激發(fā)光波長為488 nm，檢測光為560～580 nm，對樣品進(jìn)行單參數(shù)DNA含量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測藥物作用12 h對耐氟康唑白念珠菌100細(xì)胞周期中各期DNA含量，探索利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥對耐藥白念珠菌100細(xì)胞周期的影響。

不同細(xì)胞周期DNA含量百分比統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示 (見圖1～2)：空白對照組、利福噴丁組、氟康唑組及合藥組在G0/G1期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為：(76.41±1.52)%、(75.48±1.41)%、(72.36±1.01)%、(8.11±0.22)%，S期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為：(5.46±0.73)%、(8.46±0.23)%、(6.86±0.56)%、(12.52±0.54)%, G2/M期細(xì)胞計(jì)數(shù)百分比分別為：(18.14±1.11)%、(16.06±1.37)%、(20.78±1.48)%、(79.37±0.52)%。G0/G1期：生長對照組、利福噴丁組及氟康唑組兩兩比較，其組間DNA含量均無明顯差異 (P>0.05)；聯(lián)合用藥組DNA含量較低，與生長對照組及單藥組相比，均有顯著性差異 (P<0.01)。S期：與生長對照組相比，氟康唑組DNA含量無差異 (P=0.224)，利福噴丁組 (P=0.043)、聯(lián)合用藥組 (P=0.01)DNA含量均有顯著性差異；利福噴丁、氟康唑單藥組與聯(lián)合用藥組兩兩比較顯示，利福噴丁組與氟康唑組之間DNA含量無差異 (P>0.086)，單藥組與聯(lián)合用藥組DNA含量均有顯著性差異 (P<0.01)。G2/M期：生長對照組、利福噴丁組及氟康唑組兩兩比較，其組間DNA含量均無明顯差異 (P>0.05)；聯(lián)合用藥組DNA含量明顯增加，與生長對照組及單藥組相比，均有顯著性差異 (P<0.01)。這說明聯(lián)合用藥組細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，即聯(lián)合用藥可抑制白念珠菌的正常分裂增殖。

圖1 利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用12 h后耐藥白念珠菌各期細(xì)胞百分比 圖2 利福噴丁、氟康唑單用及兩藥合用12 h后耐藥白念珠菌胞內(nèi)DNA含量變化

Fig.1 Histogram indicating the percentages of FLC-resistanceCandidaalbicanscells treated with different drugs for 12 h in cycle progress. Results are shown as mean±SD；***P<0.001 vs FCZ group；##P<0.01 vs RFT group，###P<0.001 vs RFT group Fig.2 DNA contents of FLC-resistanceCandidaalbicanscells treated with Fluconazole or Rifapentine alone and combination for 12 h

3 討 論

流式細(xì)胞術(shù) (Flow Cytometry，F(xiàn)CM)是一項(xiàng)發(fā)展迅速的新型生物醫(yī)學(xué)分析技術(shù)，因其檢測速度快、精確度高、靈敏度高等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)DNA含量的檢測。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量的主要原理是用化學(xué)定量方式對細(xì)胞內(nèi)DNA進(jìn)行染色，DNA結(jié)合熒光染料后，在流式細(xì)胞儀內(nèi)受激光激發(fā)而發(fā)出不同的熒光束，根據(jù)熒光強(qiáng)度區(qū)分細(xì)胞周期中各期DNA含量，可將檢測樣本細(xì)胞分為二倍體的G0/G1期，二倍體與四倍體之間的S期，四倍體的G2/M期。

細(xì)胞周期指從一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞開始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞結(jié)束所經(jīng)歷的過程。白念珠菌為真核細(xì)胞生物，其細(xì)胞周期分為G0期 (此期細(xì)胞處于停止分裂狀態(tài)，具有潛在分裂能力，細(xì)胞內(nèi)是二倍體DNA)、G1期 (細(xì)胞有絲分裂完成到DNA復(fù)制之前的時期，又稱合成前期，細(xì)胞內(nèi)是二倍體DNA)、S期 (DNA的合成期，是二倍體DNA到四倍體DNA的過程)、G2期 (DNA合成終止，為有絲分裂的準(zhǔn)備期，此時細(xì)胞內(nèi)含四倍體DNA)、M期 (細(xì)胞的有絲分裂期，此時細(xì)胞內(nèi)為四倍體DNA)[4]。

本課題組前期藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：對多株耐藥白念珠菌臨床分離株，利福噴丁單用無抗菌活性，聯(lián)合用藥后利福噴丁的MIC80值由單用時的>1 024 μg/mL，下降至32～64 μg/mL，氟康唑的MIC80值由單用時的>64 μg/mL，下降至1～8 μg/mL，F(xiàn)ICI均<0.5，兩藥的相互作用為協(xié)同作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測利福噴丁、氟康唑單用及聯(lián)合用藥細(xì)胞內(nèi)DNA含量變化，觀察其對耐藥白念珠菌細(xì)胞周期的影響。結(jié)果顯示，利福噴丁、氟康唑單藥組與對照組相比無顯著差異，聯(lián)合用藥組G0/G1期DNA含量減少 (P<0.01)，G2/M期DNA含量顯著增加 (P<0.01)。氟康唑主要通過抑制白念珠菌麥角甾醇的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞膜的完整性發(fā)揮抑菌效應(yīng)，因此其抗真菌機(jī)制與細(xì)胞周期無明顯關(guān)系。利福噴丁抗細(xì)菌作用機(jī)制主要是通過競爭性結(jié)合依賴DNA的RNA多聚酶β亞單位，阻礙細(xì)菌mRNA的合成，進(jìn)而影響DNA及蛋白質(zhì)合成，最終致細(xì)菌死亡[5]。

細(xì)胞的正常分裂增殖是一個極其復(fù)雜又精準(zhǔn)過程，真核細(xì)胞能夠使細(xì)胞周期正確地開啟和結(jié)束，依賴于細(xì)胞內(nèi)周期調(diào)控系統(tǒng)[6]。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)藥物作用后，可發(fā)生DNA損傷，細(xì)胞會啟動細(xì)胞周期自查及修復(fù)，若細(xì)胞損傷被及時修復(fù)，則細(xì)胞周期繼續(xù)進(jìn)入下一個階段。如果細(xì)胞損傷持續(xù)存在或損傷嚴(yán)重，無法被修復(fù)，則細(xì)胞周期將不能從一個階段進(jìn)入下一個階段，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞周期阻滯[7-8]。G2/M期為細(xì)胞增長及有絲分裂期，在此期間，DNA合成停止，主要為RNA及蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而完成分裂增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示聯(lián)合用藥組G2/M期DNA含量均顯著增加，這表明聯(lián)合用藥后大量細(xì)胞在G2/M期堆積，導(dǎo)致細(xì)胞無法進(jìn)入下一個細(xì)胞周期。由此推測，由于利福噴丁分子量較大，無法直接透過真菌細(xì)胞壁或細(xì)胞膜直接對真菌造成損傷，與氟康唑合用時，可通過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮其協(xié)同抗菌作用。利福噴丁對白念珠菌的損傷不能被及時修復(fù)，為一種不可逆損傷，細(xì)胞無法進(jìn)一步正常分裂增殖，細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。Li等[9]和呂霞琳等[10]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿、漢防己甲素聯(lián)合氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫?xì)胞周期也有一定的阻滯作用。目前，尚未見關(guān)于利福噴丁對白念珠菌細(xì)胞周期影響的文獻(xiàn)報道。本實(shí)驗(yàn)表明利福噴丁和氟康唑聯(lián)合用藥時對耐藥白念珠菌的細(xì)胞周期有阻滯作用，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。