劉曉宇 張常建 胡穎嵩 陳芳艷 韓黎

(1.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院，北京 100039；2.解放軍疾病預防控制所 醫(yī)院感染監(jiān)控中心，北京 100071)

煙曲霉 (Aspergillusfumigatus)是一種腐生性條件致病真菌，可產(chǎn)生大量的孢子，漂浮于空氣中，一般情況下對正常人不致病，但容易感染免疫力低下群體，如接受器官移植的患者、化療放療的癌癥患者、HIV患者、中性粒細胞減少癥患者及長期使用激素的患者等，感染后會發(fā)展為曲霉腫、支氣管肺曲霉病及侵襲性肺曲霉病 (invasive pulmonary aspergillus,IPA)等多種肺部疾病[1]。侵襲性肺曲霉病是一種嚴重危及生命的肺部感染疾病，病死率極高，未治療患者可達90%以上、經(jīng)治療患者有50%～70%，研究煙曲霉的致病機制及機體對煙曲霉的清除過程非常重要[2]。

磷脂酶D (Phospholipase D,PLD)是一種普遍存在的磷脂酶類，主要作用是水解磷脂酰膽堿 (Phosphatidylcholine,PC)3位末端的酯鍵產(chǎn)生膽堿和一種重要的第二信使分子-磷脂酸 (Phosphatidic acid,PA)。在哺乳動物中發(fā)揮主要作用的PLD有兩種亞型，PLD1和PLD2[3]。近期很多研究發(fā)現(xiàn)，由PLD催化產(chǎn)生的PA參與多種細胞過程，如細胞骨架重排、膜泡運輸、胞吞胞吐作用、細胞自噬等[4]，而且癌癥、炎癥性疾病及微生物感染等疾病患者細胞中都能發(fā)現(xiàn)PLD的異常表達及活性改變[5]。磷脂酶D對巨噬細胞的吞噬能力非常重要，此領域已有很多研究[6-9]，如文獻報道，由于PLD缺陷的巨噬細胞肌動蛋白骨架重排受阻，引起該細胞對假結核病耶爾森菌和IgG包裹顆粒的吞噬能力都顯著下降[6]。至于殺菌作用，有文獻報道PLD通過參與第二信使二酰甘油的合成參與巨噬細胞對鼠傷寒沙門氏菌的清除，這是細胞通過異體自噬殺滅病原體的途徑[10]。而在真菌感染領域宿主巨噬細胞PLD功能的研究卻幾乎沒有。

我們課題組的既往研究發(fā)現(xiàn)，在煙曲霉感染人肺泡上皮細胞系A549時，細胞PLD的活性顯著升高，PLD抑制劑可以顯著抑制煙曲霉孢子內(nèi)化侵入A549細胞[11]，說明PLD在A549細胞應對煙曲霉感染過程中發(fā)揮重要作用。那么宿主在體內(nèi)應對煙曲霉感染時，其PLD有什么重要作用？為闡明在機體免疫功能正常的情況下，PLD缺失對機體應對煙曲霉感染的影響，我們利用pld1基因和pld2基因同時敲除小鼠 (pld1-/-pld2-/-)，在小鼠免疫功能正常的情況下，研究小鼠PLD在清除肺部煙曲霉孢子過程中所發(fā)揮的作用。因為在機體免疫功能正常的情況下，肺泡巨噬細胞在清除煙曲霉感染時發(fā)揮主要作用，所以我們選擇巨噬細胞作為研究對象。

1 材料與方法

1.1 菌株

煙曲霉B5233菌株，生長于沙氏培養(yǎng)基 (SDA)，37℃培養(yǎng)箱生長3～5 d后，用含0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液 (PBST)收集孢子，40 μm濾器過濾去除菌絲，然后用PBST洗兩遍后計數(shù)，4℃保存。

1.2 實驗動物及細胞

pld敲除小鼠 (pld1-/-pld2-/-)由德國BernhardNieswandt教授研究組惠贈。C57BL/6J野生小鼠，雄性，體質(zhì)量 (20±2) g，SPF級，購自軍事科學院軍事醫(yī)學研究院豐臺動物中心，兩種小鼠均飼養(yǎng)于軍事科學院軍事醫(yī)學研究院豐臺實驗動物飼養(yǎng)中心。實驗動物福利倫理審查編號為IACUC-13-2016-002。小鼠BMDM細胞是分離的小鼠骨髓細胞經(jīng)巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)誘導分化的成熟巨噬細胞。

1.3 實驗方法

小鼠肺部真菌負荷檢測pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取30只，異氟烷麻醉，通過鼻滴方式感染，劑量為5×106CFU/只。感染后6 h、24 h、72 h及7 d分別取6只小鼠解剖，取整個肺組織，稱重，加入適量PBS，用勻漿器勻漿，涂布于SDA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱孵育18～20 h后取出計數(shù)并計算真菌負荷。

小鼠支氣管肺泡灌洗液 (BALF)收集及其細胞收集和迪夫快速染色 感染前和感染后6 h時pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取6只，腹腔注射150 μL 25%的烏來糖麻醉，將小鼠仰臥固定，75%酒精擦拭消毒頸部及胸部，剪開頸部皮膚及肌肉，暴露氣管，抽取支氣管肺泡灌洗液，每次緩慢注入1 mL無菌PBS，重復3次，抽回的液體各放在1個1.5 mL無菌EP管中，2 500 r/min離心10 min，收集上清，用于炎癥因子檢測；細胞沉淀用無菌PBS重懸，2 500 r/min離心10 min，去除上清，RPMI 1640培養(yǎng)基懸浮細胞，計數(shù)，用迪夫快速染色試劑盒 (Diff-Quik Stain)對細胞進行染色。

小鼠骨髓細胞分離和誘導分化pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各取1只，麻醉后斷頸法處死，浸入75%乙醇中1～2 min。在超凈工作臺中分離小鼠的股骨和脛骨，放入裝有RPMI 1640培養(yǎng)基的小皿中，用1 mL注射器吸取培養(yǎng)基，將針頭尖插入股骨和脛骨中，沖出骨髓細胞。用40 μm細胞篩網(wǎng)過濾，去除碎片。將過濾后的細胞懸液轉移至50 mL離心管中，4℃，500 g，離心8 min，沉淀即是骨髓細胞。用RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，3～4 mL培養(yǎng)基重懸細胞計數(shù)。

用含50 ng/mL M-CSF刺激因子和10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓細胞，按照2×105個細胞每毫升鋪于96孔板，每孔100 μL。在培養(yǎng)的第2天加入50 μL新鮮含刺激因子和血清的1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，第4天小心去除懸浮的細胞和培養(yǎng)基，重新加入含50 ng/mL M-CSF的新鮮10% FBS 1640培養(yǎng)基100 μL。在培養(yǎng)的6～8 d得到最大量的BMDM細胞。

制霉菌素法檢測BMDM細胞吞噬率 按上述方法接種細胞，pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各接種3組，每組3孔。實驗前1天將BMDM細胞培養(yǎng)上清換成含1%FBS的1640培養(yǎng)基，撤走M-CSF，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后吸走培養(yǎng)基，換上新鮮的不含血清的1640培養(yǎng)基，按感染比10∶1加入煙曲霉B5233休眠孢子，第1組感染30 min、第2組感染60 min、第3組感染120 min，吸走上清，PBS洗2～3遍，加入含25 μg/mL制霉菌素的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 h，殺死未被吞噬的煙曲霉孢子，棄上清，PBS洗2～3遍，加入100 μL 0.25%的TritonX-100裂解細胞15 min，用槍頭將細胞刮下，吹打混勻后取40 μL加入360 μL PBS中混勻，再稀釋10倍，取90 μL涂布再SDA平板上，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后取出計數(shù)并計算吞噬率，計算方法[(每個板的菌落數(shù)÷0.9)×稀釋倍數(shù)]÷加入孢子數(shù)×100。

小鼠BMDM細胞殺菌能力檢測 按上述方法接種細胞，pld1-/-pld2-/-小鼠和野生小鼠各接種4組，每組3孔。實驗前操作同上，然后按感染比10∶1加入煙曲霉B5233休眠孢子，均感染1 h，棄上清，用PBS洗滌2次，第1組直接裂解細胞涂板，方法同上，其余各組均加上新鮮的1640培養(yǎng)基，第2組繼續(xù)培養(yǎng)4 h后裂解涂板，第3組繼續(xù)培養(yǎng)6 h后裂解涂板，第四組繼續(xù)培養(yǎng)8 h后裂解涂板。37℃培養(yǎng)箱孵育24 h后計數(shù)計算殺菌效率，計算方法 (第1組菌落數(shù)-第2組、第3組或第4組的菌落數(shù))÷第1組菌落數(shù)。

小鼠肺泡灌洗液炎癥因子含量檢測 采用eBioscience公司的多因子檢測試劑盒對BALF中的炎癥因子進行檢測。

統(tǒng)計分析 每個實驗重復3次，所有計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組計量資料間的比較采用one-way ANOVA分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 pld1-/-pld2-/-小鼠清除肺組織中煙曲霉孢子的能力下降

免疫功能正常的情況下，感染相同劑量的煙曲霉孢子，隨著感染后時間的延長，兩種小鼠肺組織中煙曲霉負荷都逐漸下降，但pld1-/-pld2-/-小鼠肺組織真菌負荷始終高于野生小鼠；盡管兩種小鼠都能在感染后1周內(nèi)完全清除肺組織的煙曲霉孢子，但是野生小鼠在感染后第3天肺組織中煙曲霉負荷幾乎下降到0，而pld1-/-pld2-/-小鼠需要更長的時間來清除 (見圖1a)，說明pld1-/-pld2-/-小鼠清除煙曲霉感染的能力較弱。另外，迪夫快速染色結果顯示，感染前和感染后6 h，支氣管肺泡灌洗液中基本都是巨噬細胞，而感染后6 h，pld1-/-pld2-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液中可見大量的游離的及被巨噬細胞吞噬的煙曲霉孢子，孢子量顯著高于野生小鼠組 (見圖1b～c)，說明pld1-/-pld2-/-小鼠肺泡灌洗液中巨噬細胞的殺菌能力可能減弱。

2.2 pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力降低

為了進一步證明pld1-/-pld2-/-小鼠巨噬細胞的殺菌能力降低，我們分離了小鼠骨髓細胞，將其誘導分化為成熟的巨噬細胞 (BMDM)進行體外巨噬細胞吞噬實驗和殺菌實驗檢測，發(fā)現(xiàn)，隨著感染時間的延長，兩種巨噬細胞吞噬煙曲霉孢子的量均逐漸顯著升高，但是pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細胞吞噬孢子的數(shù)量始終低于野生小鼠BMDM細胞組 (見圖2a)；隨著殺菌時間的延長，兩種巨噬細胞殺滅孢子的數(shù)量也逐漸增加，但是當殺菌時間≥6 h時，pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細胞殺滅孢子的數(shù)量顯著低于野生小鼠BMDM組 (見圖2b)。結果表明，pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細胞的吞噬能力和殺菌能力均顯著低于野生小鼠 (*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2.3 pld1-/-pld2-/-小鼠應對煙曲霉孢子刺激過程中分泌更多的炎癥因子

為了評估感染煙曲霉孢子后pld1-/-pld2-/-小鼠支氣管肺泡灌洗液 (BALF)中的炎癥因子分泌情況，我們分別在感染前和感染后6、24、72 h和7 d獲取BALF進行多種炎癥因子檢測，結果顯示隨著感染后時間的延長，炎癥因子IL-6、GRO-α及TNF-α含量的變化趨勢均為先升高后下降，感染后第7天時都已經(jīng)恢復至正常水平；檢測的幾個時間點內(nèi)，6 h炎癥因子含量最高；值得注意的時，感染后6 hpld1-/-pld2-/-小鼠BALF中這些炎癥因子的含量均顯著高于野生小鼠 (*P<0.05，見圖3)。說明pld1-/-pld2-/-小鼠應對煙曲霉孢子刺激過程中可能需要分泌更多的炎癥因子來參與殺滅孢子過程。

3 討 論

煙曲霉是一種腐生真菌，其表面的病原相關分子模式和細菌表面的大為不同，感染所引起的細胞內(nèi)反應也是不同的。肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞是抵抗煙曲霉感染的第1道防線，對機體及時清除煙曲霉孢子尤為重要[12]。正常情況下，機體肺泡中存在固有巨噬細胞，當孢子被吸入后，肺泡巨噬細胞可以吞噬并殺滅絕大多數(shù)的煙曲霉孢子。

圖1pld1-/-pld2-/-小鼠清除肺部煙曲霉孢子能力下降。a.小鼠肺組織煙曲霉負荷；b.小鼠感染煙曲霉6 h后，收集BALF中的細胞和孢子，迪夫試劑快速染色，鏡下觀察 (bar=25 μm)，圖中紅色箭頭指的是煙曲霉孢子；c.對b圖視野中孢子數(shù)量進行統(tǒng)計 (每組統(tǒng)計20個視野)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 圖2pld1-/-pld2-/-小鼠BMDM細胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力下降。a.吞噬實驗，圖中箭頭表示隨著吞噬時間的延長，兩種小鼠對煙曲霉孢子的吞噬率顯著上升；b.殺菌實驗 (煙曲霉孢子：BMDM=10∶1) 圖3 感染后BALF中炎癥因子濃度 (*P<0.05)

Fig.1 PulmonaryA.fumigatusspores eliminating inpld1-/-pld2-/-mice was lower than that in wild mice. a. Fungal burdens in mice lung tissue; b. Diff-Quik Stain results of spores in BALF of mice infected withAspergillusfumigatusfor 6 hours (the red arrow pointed); c. Spore counting of Fig.1b (20 fields were counted each group) Fig.2 BMDM cells ofpld1-/-pld2-/-mice showed decreased ability to phagocyte and killAspergillusfumigatusconidia. a. Phagocytosis: the phagocytosis rate ofAspergillusfumigatusin the BMDM cells increased significantly with the prolongation of the phagocytosis time; b. Fungicidal experiment Fig.3 Expression of cytokines in BALF of mice

近幾年已有研究報道，巨噬細胞殺滅煙曲霉的機制不同于經(jīng)典的吞噬作用和異體自噬作用，而是一種非典型的自噬通路-LC3相關的吞噬作用 (LC3-associated phagocytosis,LAP)[13-14]。我們發(fā)現(xiàn)，pld1-/-pld2-/-小鼠巨噬細胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力均減弱，說明PLD可能參與LAP過程，也是我們今后的研究方向，研究清楚PLD如何參與LAP殺菌過程，對正確理解巨噬細胞殺滅煙曲霉的機制非常重要。

免疫功能正常的宿主在吸入煙曲霉孢子后會引起輕度而短暫的炎癥反應以清除孢子，而我們發(fā)現(xiàn)，pld1基因和pld2基因同時缺失后，由于巨噬細胞吞噬殺菌能力以及其他免疫功能的下降，小鼠支氣管BALF中的孢子量和整個肺組織中的煙曲霉真菌負荷遠大于野生組。在這種情況下，機體可通過分泌更多的炎癥因子以募集其他的免疫細胞來清除感染，通過多因子檢測，我們發(fā)現(xiàn)感染后6 h，pld1-/-pld2-/-小鼠BALF中促炎細胞因子GRO-α、TNF-α和IL-6的含量顯著高于野生小鼠。GRO-α是一種趨化因子，可以募集中性粒細胞至肺組織感染部位[15]。TNF-α可以提高中性粒細胞的吞噬能力，而IL-6能刺激參與免疫反應的細胞增值和分化并提高其功能，這都有助于增強機體的免疫力。但是眾所周知，過度的炎癥反應對機體是不利的，TNF-α和IL-6同時也是促炎因子，參與炎癥反應的發(fā)生，在機體發(fā)生炎癥損傷時總是含量較高，如果PLD缺陷的個體受到煙曲霉的持續(xù)感染，可能會引起機體急性炎癥損傷[16-19]。

我們的研究說明PLD缺失后，肺泡巨噬細胞吞噬和殺滅煙曲霉孢子的能力的下降可能是影響機體抗煙曲霉感染進程的原因之一，同時，PLD缺失后高負荷的煙曲霉可能會引起肺部的炎癥損傷。本課題還會進一步評估PLD缺陷對其他免疫細胞募集的影響以及對小鼠肺泡上皮屏障功能的影響，同時，也會展開PLD對免疫缺陷機體應對煙曲霉感染的影響研究。在體外我們會繼續(xù)研究PLD如何參與巨噬細胞的殺菌能力，還會基于之前的發(fā)現(xiàn)研究PLD在上皮細胞應對煙曲霉感染中的作用，為煙曲霉的感染機制及機體的抗感染機制提供有力依據(jù)。