王思佳

（國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100039）

1 技術(shù)概述

CAR-T療法，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受體T細胞免疫療法。其主要原理是，從癌癥病人身上分離免疫T細胞，利用基因工程技術(shù)為T細胞引入一個能夠識別腫瘤細胞并同時激活T細胞的嵌合抗體，也就是制備CAR-T細胞，再將擴增好的CAR-T細胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，通過免疫療法對抗癌細胞。最近使用這種方法治療頑固性B細胞惡性腫瘤的患者已經(jīng)表現(xiàn)出卓越的臨床療效[1]。截至目前，全球共有2種CAR-T產(chǎn)品獲批上市，分別是來自諾華的Kymriah（tisagenlecleucel）和Kite制藥的Yescarta（KTE-C19），它們分別用于治療兒童和年輕成人（2～25歲）的急性淋巴細胞白血病和特定類型大B細胞淋巴瘤。2017-12-08，金斯瑞生物科技公司旗下的南京傳奇生物科技有限公司率先在國內(nèi)申報了CAR-T細胞臨床試驗。2018-03-08，日本山口大學免疫學系統(tǒng)的玉田耕治（Koji Tamada）教授宣布開發(fā)出可以表達IL7和CCL19兩種趨化因子的全新一代CAR-T，這使得CAR-T可以模仿淋巴組織中的網(wǎng)狀成纖維細胞，召集其他部位的免疫細胞進入腫瘤組織，共同對抗實體瘤[2]。這一突破為CAR-T療法在實體瘤領(lǐng)域帶來了新的希望。當CAR-T療法奏效時，它會引進一種定制的“生物學刺客”讓身體的免疫系統(tǒng)對抗癌癥。這種方法的出現(xiàn)大大拓展了T細胞療法的應(yīng)用范圍。

CAR-T療法的概念最早是由德國洪堡大學Zelig Eshhar教授提出。Zelig Eshhar將抗體的輕重鏈連接到T細胞表面TCR的恒定區(qū)上，隨后又將scFv替換輕重鏈，避免了多次重復的轉(zhuǎn)基因。此為第一代CAR-T療法，隨后陸續(xù)應(yīng)用到臨床上。然而這些早期的臨床研究沒有獲得理想的效果，響應(yīng)率不佳，而且在靶向CAIΧ（碳酸酐酶IΧ）的CAR-T療法中，出現(xiàn)了膽源性毒性的副作用，意味著CAR-T在作用于正常組織中靶標時存在可能引起毒性的風險。CAR-T療法的第一個積極臨床結(jié)果于2008年公布，位于休斯敦的Baylor醫(yī)學院的Malcolm Brenner研究組——靶向GD2的CAR-T療法，盡管24 h后血液中CAR-T細胞含量不足0.1%，仍使得11名兒科成神經(jīng)細胞瘤患者中的3人完全緩解。隨之而來的一個主要問題是如何保證CAR-T細胞的長期存活。二代CAR-T引入了共刺激信號4-1BB或CD28，前者通過上調(diào)Bcl-xL延長T細胞的存活期，后者可以增強T細胞響應(yīng)的效價。

三代CAR-T引入2個以上的共刺激信號。第一個三代CAR-T的臨床研究為靶向HER2的CAR-T療法，適應(yīng)癥為轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。HER2靶點在單抗領(lǐng)域已經(jīng)成功應(yīng)用多年，抗腫瘤基因治療藥物赫賽汀成功治療超過40萬名女性乳腺癌患者，表現(xiàn)出很小的毒性?；谶@些經(jīng)驗，NCI（美國國家癌癥研究院）選擇將靶向HER2的scFv應(yīng)用到CAR-T療法上，用于治療HER2+黑色素瘤。首例患者接受了高濃度的CAR-T細胞——1×1011個細胞?；颊呓邮苤委熀螅瑤追昼姾缶捅憩F(xiàn)得極為痛苦，很快陷入昏迷，Χ光顯示嚴重的肺浸潤。醫(yī)生給予高劑量激素干預，患者仍在5 d后死亡。隨后發(fā)現(xiàn)患者全身遍布CAR-T細胞，肺部最為嚴重，進一步分析肺部上皮細胞表達HER2，發(fā)現(xiàn)其可能是導致肺部T細胞浸潤引發(fā)死亡的主要原因。

2 專利申請情況

筆 者 以 [B/“CAR-T”and B/therapy] 這 一 檢 索 式 在Patentics的全部數(shù)據(jù)庫中進行檢索。檢索的截止時間為2017-05-26，共獲得1 515篇專利申請文獻。

圖1是CAR-T療法全球?qū)＠暾垥r間趨勢圖。CAR-T療法全球?qū)＠暾堉饕性贏61K35/17、C07K16/44和C12N這三個分類號，如圖1所述，CAR-T療法相關(guān)專利最早出現(xiàn)在1998年，此后申請量一直在個位數(shù)徘徊，直至2013年開始，申請量大幅上升，2015年共申請267件。申請人主要集中在賓夕法尼亞大學、諾華公司、Baylor醫(yī)學院和美國衛(wèi)生部，涉及到的發(fā)明點主要集中在一些特異性CAR分子、治療方法及表達CAR的效應(yīng)T細胞的制備方法等方面。

圖1 CAR-T療法全球?qū)＠暾垥r間趨勢圖

筆者以[B/“CAR-T”and B/治療 or 療法]這一檢索式在Patentics的中國申請中進行檢索。檢索的截止時間為2017-05-26，獲得306篇專利申請文獻。

圖2是CAR-T療法中國專利申請時間趨勢圖。從圖中可以看出，我國的CAR-T技術(shù)還處于起步階段，直至2015年，申請量開始呈上升趨勢，至2016年達到頂峰，至2016-09，申請量達到59件。

圖2 CAR-T療法中國專利申請時間趨勢圖

圖3 CAR-T療法中國專利的申請人分布圖

圖3是CAR-T療法中國專利的申請人分布圖。從圖中可以看出，國內(nèi)主要開展CAR-T技術(shù)研發(fā)的企業(yè)集中在以蘇州普羅達生物科技有限公司（涉及低質(zhì)申請，多數(shù)視撤）和上海優(yōu)卡迪生物醫(yī)藥科技有限公司為首的長江三角以及江浙一帶，涉及到的發(fā)明點主要集中在一些應(yīng)用于CAR-T療法的多肽和一些CAR轉(zhuǎn)基因載體及其構(gòu)建方法等方面。

3 技術(shù)發(fā)展方向

3.1 CAR-T免疫療法毒性的減輕

CAR-T免疫療法具有明顯的毒性，大致可分為4類，即腫瘤溶解綜合癥、細胞因子釋放綜合癥、神經(jīng)毒性和靶標毒性。以下依次介紹這幾種毒性的反應(yīng)及減輕它們的方法。

3.1.1 腫瘤溶解綜合癥

腫瘤溶解綜合癥，是指代謝干擾的組合，其主要表現(xiàn)為升高的血清尿酸、鉀和磷酸鹽以及低血鈣癥，甚至有時會發(fā)展為腎衰竭，可能會使大量腫瘤細胞迅速消除。在血液惡性瘤的情況下，這些現(xiàn)象在遞送CAR-T細胞的晚期患者中表現(xiàn)得尤其突出[3-4]，推測是CAR-T細胞的體內(nèi)擴張導致腫瘤被破壞。減少腫瘤溶解綜合癥這類免疫副反應(yīng)通常會依賴于改造的CAR多肽，比如WO2017024318A1公開了一種包含1個CAR多肽的免疫效應(yīng)細胞。該CAR多肽包括1個胞外配體結(jié)合域、1個跨膜域、1個包含至少1種胞內(nèi)信號域的胞質(zhì)域和1個能夠與一種雙雜合化合物結(jié)合的異化合物靶蛋白（dTAG）。該雙雜合化合物能夠通過dTAG結(jié)合上述CAR多肽和泛素連接酶。與通過自殺基因快速誘導CAR-T細胞死亡的模式相比，通過1個CAR-T細胞內(nèi)靶向CAR泛素化和降解的雙雜合化合物，實現(xiàn)了CAR表達的可逆性控制和接下來的T細胞反應(yīng)，同時，還節(jié)省了CAR-T細胞自身。dTAG就像1個CAR表達的電阻器，當CAR-T細胞受到刺激時，就能夠通過注射雙雜合化合物來調(diào)節(jié)CAR的表達和CAR-T細胞免疫反應(yīng)的程度，并通過清除該化合物再生CAR受體。更進一步地說，在CAR構(gòu)建體中嵌入一個雙雜合化合物靶蛋白，腫瘤溶解綜合癥的副反應(yīng)就可以通過注射一種與靶蛋白匹配的雙雜合化合物，在控制CAR表達的同時維持CAR-T細胞在化合物被清除且CAR受體重新表達時重新激活的功能。

3.1.2 細胞因子釋放綜合癥

細胞因子釋放綜合癥（CRS）是由CAR-T細胞免疫療法誘導的最常見的危及生命的毒性反應(yīng)。它是指釋放來自幾個白細胞群的一系列細胞因子，最顯著的是T細胞和單核吞噬細胞的細胞系，從中可能會檢測出高循環(huán)水平的多種促炎細胞因子，包括腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-g和IL-6。在一些病例中，巨噬細胞激活綜合癥會伴隨著CRS，這是應(yīng)當引起注意的。因為CAR-T細胞的臨床前模型誘導的CRS表明，巨噬細胞激活綜合癥是疾病發(fā)病機理的一個關(guān)鍵組成部分。新的證據(jù)表明，細胞因子釋放綜合癥的嚴重程度依賴于疾病負擔。由于CRS的快速發(fā)展，有必要密切監(jiān)視患者的狀況，尤其是在CAR轉(zhuǎn)化細胞后的24～48 h之間。然而，延遲的CRS也會發(fā)生，特別是當細胞由小的起始數(shù)目進行大規(guī)模體內(nèi)擴張時。因此，CRS的管理成為具有挑戰(zhàn)性的難題，因為在一定程度上講，細胞因子的釋放會伴隨T細胞激活和效應(yīng)器活動，同時，治療封鎖該過程可能需要使用一種或多種免疫抑制劑。WO2017025638A1公開了這樣一種免疫抑制劑，主要針對于激活了的T細胞的細胞核因子。另一方面，嚴重的CRS可能很快就會致命，在一例涉及到HER2的 CAR-T細胞治療的患者中不幸發(fā)生了此悲劇[5]。最近，除了這種癥狀的治療方法外，還提出了診斷和分級系統(tǒng)。血清C反應(yīng)蛋白（CRP）已被確定為潛在的CRS生物標定物，補充臨床參數(shù)便于對需要更多治療的患者進行分級。根據(jù)患者的嚴重程度，治療可能涉及到癥狀治療、液體置換、輸氧和血管加壓藥以及施加免疫抑制劑，比如IL-6受體α-阻斷抗體、托珠單抗和/或皮質(zhì)類固醇。

3.1.3 神經(jīng)毒性

神經(jīng)毒性是CAR-T細胞療法引起的另一種嚴重的潛在毒性，并已在用CD19靶向治療的幾例患者中觀察到。神經(jīng)毒性的癥狀包括視覺幻覺、譫妄、功能障礙和癲癇發(fā)作，這種毒性的起因尚不清楚。盡管在大多數(shù)用CD19 CAR-T療法治療的患者的腦脊髓液（CSF）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CD19 CAR-T細胞（忽略腦病的嚴重程度），所有6/21有神經(jīng)毒性反應(yīng)的患者都有更高濃度的腦脊髓液CAR-T細胞，但并非所有表現(xiàn)出神經(jīng)毒性的患者在其CSF中都有CAR-T細胞，盡管在CSF收集時出現(xiàn)了臨床性精神障礙。由于在用blinatumomab（一種T細胞活化的雙特異性抗體與腫瘤細胞上的CD19和T細胞上的CD3接合）治療的患者中也觀察到了神經(jīng)毒性[6]，因此，推測毒性是來自于廣義T細胞介導的炎癥而不是靶性CAR-T細胞對CNS組織（中樞神經(jīng)系統(tǒng)）的攻擊。迄今為止的兩大臨床試驗同時證明，神經(jīng)毒性是完全可逆和自限的，它仍是CAR-T細胞療法的一個明顯難題，尤其是其與CRS的嚴重程度無關(guān)，因此就更加難以預測。理解神經(jīng)毒性背后的機制對于開發(fā)更安全的CAR-T細胞療法以及更加有效地管理這些副反應(yīng)至關(guān)重要。

3.1.4 靶標毒性

靶標毒性即脫靶是指CAR-T細胞免疫反應(yīng)介導的表達靶抗原的正常組織排斥反應(yīng)。該毒性反應(yīng)從CD19傾向性的靶向CAR-T細胞引起的B細胞發(fā)育不全得到了最好的詮釋，結(jié)果是低丙種球蛋白血癥。在其他不可治愈的B細胞腫瘤存在的情況下，這種毒性被認為是可以接受的，因為它能夠通過實施靜脈內(nèi)或皮下免疫球蛋白置換治療來得到緩解。另一個例子是由CAIΧ（碳酸酐酶IΧ）重新靶向CAR-T細胞誘導的肝毒性[7]。靶標毒性是CAR-T細胞免疫療法的一個特殊難題，因為大多數(shù)靶點是在正常組織中表達的自身抗原。

3.2 CRISPR讓CAR-T繼續(xù)“開車”

基因組編輯工具CRISPR-Cas系統(tǒng)的飛速發(fā)展引發(fā)了生物學領(lǐng)域的一場革命?；贑RISPR-Cas的技術(shù)實現(xiàn)了幾乎無限制的基因操作，包括在人類細胞中操作。目前，大部分的CAR-T細胞是利用患者自身的T細胞來產(chǎn)生的，這是一個昂貴、耗時的過程。這一過程還受限于當前的生產(chǎn)制造能力。如果科學家們能夠想辦法生成通用型的CAR-T細胞，這類療法將有望變得更便捷、更便宜。因為這些現(xiàn)成的（off-the-shelf）細胞將增加能夠接受單一CAR-T細胞產(chǎn)品治療的患者數(shù)量。移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）和宿主排斥依然是這種“off-the-shelf”途徑的主要障礙，包括ZFNs和TALENs在內(nèi)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在一些研究中被用于克服這些障礙。WO2017040786A1公開了借助CRISPR基因編輯工具，以便利用更少的基因材料重組合成基因回路，并干擾一些細胞的療法，比如CAR-T療法。除了用于產(chǎn)生“off-the-shelf”版本的CAR-T細胞，基因組編輯技術(shù)還可以通過敲除編碼T細胞抑制性受體或信號分子的基因（比如CTLA4、PD1）提高CAR-T細胞的功效。一個典型的例子是，美國NIH（美國國立衛(wèi)生研究院）下屬Recombinant DNAAdvisory Committee批準的，將由CAR-T領(lǐng)軍人物 Carl June教授領(lǐng)導的一項CRISPR臨床試驗。在該試驗中，研究人員將利用Cas9在黑色素瘤靶向的CAR-T細胞中敲除編碼PD1基因以及內(nèi)源性T細胞受體的基因。Carl June教授于2016-11在Clinical Cancer Research雜志上發(fā)表的一篇論文“Multiplex genome editing to generate universal CAR T cells resistant to PD1 inhibition”中證實，在體外和動物模型研究中，CRISPR基因編輯CAR-T細胞表現(xiàn)出了強有力的抗腫瘤活性，其TCR和I類HLA雙重缺陷的T細胞同種異體反應(yīng)性（alloreactivity）降低，且沒有導致GVHD。此外，同時三重基因組編輯（增加了對PD1基因的編輯）增強了CAR-T細胞的體內(nèi)抗腫瘤活性。該綜述也提到了由我國四川大學華西醫(yī)院腫瘤學家盧鈾教授研究小組率先開展的全球首個CRISPR–Cas臨床試驗。雖然這一試驗沒有引入CAR，但利用Cas9敲除了來自肺癌患者T細胞的PD1。一些類似的用PD1敲除T細胞（PD1-knockout T cells）治療前列腺癌、膀胱癌和腎細胞癌的試驗也在啟動中。與ZFNs和TALENs等其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR–Cas能夠極快地測試任何新提出的基因改造。目前，CAR-T療法開發(fā)者與專門從事基因編輯的公司之間已經(jīng)建立了大量的合作，其中包括Novartis與Intellia Therapeutics和Caribou Biosciences、Juno Therapeutics與 Editas Medicine。

此外，南京凱迪生物科技有限公司近期申請的CN106399375A公開了利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過使用攜帶人PD1基因sgRNA和Cas9-HF核酸酶的病毒液同步感染CAR-T細胞來敲除人PD1基因，得到可靶向CD19的新型CAR-T細胞；其另一篇公開號為CN104894068A的專利申請利用CRISPR/Cas9技術(shù)將CAR分子整合到人第19號染色體上AAVS1位點的第一個內(nèi)含子內(nèi)。利用該技術(shù)，可以將CAR分子精確地整合到人T細胞基因組特定的“安全港”位點，不影響任何人體正常基因的功能，避免了使用病毒載體存在的安全隱患以及外源基因轉(zhuǎn)入基因組的遺傳毒性和免疫原性等一系列臨床風險問題。

3.3 CAR-T技術(shù)治療癌癥新思路——作為藥物輸送系統(tǒng)

作為一種“活的藥物”，CAR-T療法的應(yīng)用依然面臨著很多挑戰(zhàn)，包括缺乏足夠的持久性、抗原逃逸會導致復發(fā)、安全性低以及生產(chǎn)制備方面的問題等。不過，科學家們一直在嘗試改進這類療法。一篇題為“Loss of the HVEM Tumor Suppressor in Lymphoma and Restoration by Modified CAR-T Cells”的研究于2016-09-29發(fā)表在《細胞》雜志上。該研究提出，CAR-T細胞具有作為靶向遞送工具的潛能。科學家們將這種新型CAR-T比作“微型藥房”（micro-pharmacies），可用于精準的藥物輸送。這項研究不僅定義了導致淋巴瘤發(fā)展的關(guān)鍵病變，還鑒定出了一種潛在的新治療模式。

該研究小組首次發(fā)現(xiàn)，一個關(guān)鍵的通路在約75%的人類濾泡性淋巴瘤中被阻斷了。其中，在約50%的病例中，HVEM受體基因發(fā)生了突變。這些突變干擾了與抑制性受體BTLA間的相互作用，從而導致淋巴瘤生長，形成了支持性的微環(huán)境。隨后，研究人員注意到，這一通路中的關(guān)鍵分子能夠用于淋巴瘤的治療。他們研究了一種恢復HVEM功能的方法，即利用工程CD19導向CAR-T細胞（engineered CD19-directed CAR-T cell）將HVEM蛋白直接運輸?shù)搅馨土鲋小＿@類細胞經(jīng)過特殊的設(shè)計，能夠連續(xù)不斷地產(chǎn)生可溶性的HVEM蛋白。這些CAR-T細胞通過尋找表達CD19的B細胞，將抗癌蛋白直接傳遞至腫瘤部位，并且留在腫瘤處，提供腫瘤抑制蛋白。這些“微型藥房”在動物模型試驗中產(chǎn)生了顯著的治療反應(yīng)，并且比對照組（CAR-T細胞和CD19 CAR-T細胞）更有效。這一研究描述了一種修復腫瘤抑制性HVEM-BTLA互作的新方法，證實了CAR-T細胞除了用于直接攻擊腫瘤外，還可以通過其他途徑發(fā)揮抗癌作用。這種作為“微型藥房”的新用法有望提高精準治療的活性，降低對正常組織的影響和不必要的副作用?？茖W家們表示，還需要開展更多的研究來探索工程免疫細胞作為一個平臺輸送抗腫瘤藥物的這種新治療模式。

4 總結(jié)

目前，CAR-T療法是治療血液惡性腫瘤的一個不錯選擇，其安全性，特別是確認安全的抗原靶點仍然是我們關(guān)注的重點。然而，隨著臨床經(jīng)驗的增多，這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了重大發(fā)展，現(xiàn)在由于CRS的分級系統(tǒng)，其毒性管控變得越來越先進。另外，有可能將CAR-T細胞療法與常規(guī)化學治療或其他新型免疫治療，比如免疫檢查點抑制劑相結(jié)合。相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，為發(fā)展“off-the-shelf”的CAR-T細胞的CRISPR技術(shù)，以及CAR-T細胞作為藥物輸送系統(tǒng)的應(yīng)用，提供了新機遇；再加上CAR-T療法商業(yè)關(guān)注度的增加，也會加快CAR-T細胞療法作為一線治療投入臨床使用的速度。