王雪忠張戰(zhàn)泓鄭立敏唐 鑫史曉斌劉 勇*

（1湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125；2湖南省植物保護研究所，湖南長沙 410125；3湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125）

番 茄 褪 綠 病 毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），于1998年在美國佛羅里達州首次發(fā)現(xiàn)（Wisler et al.，1998）。截至目前，ToCV已在我國臺灣、北京、山東、天津、河北和河南等地發(fā)生流行，對各地番茄生產(chǎn)造成了嚴重影響（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；劉永光 等，2014；周濤 等，2014；胡京昂 等，2015；孫國珍 等，2015）。ToCV侵染的典型癥狀是植株下部葉片先觀察到葉脈間黃化褪綠。發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持綠色外，脈間變黃，葉片變厚；發(fā)病中期，整個葉片由邊緣向內(nèi)開始出現(xiàn)壞死斑；發(fā)病后期，整個植株死亡，果實受到嚴重影響（趙黎明，2015）。早期感染ToCV的番茄產(chǎn)量損失可達到75%，甚至絕產(chǎn)；中后期感染ToCV仍會對番茄造成10%～40%的產(chǎn)量損失（劉永光 等，2014）。該病毒的寄主主要有茄科（Solanaceae）和夾竹桃科（Apocynaceae）等 6個 科 植 物（Wintermantel & Wisler，2006；Landeo-Ríos et al.，2015），其中對番茄造成的產(chǎn)量損失最為顯著。ToCV只能通過韌皮部侵染的方式侵染植物，由媒介昆蟲以半持久的方式傳播，其媒介昆蟲包括煙粉虱（Bemisia tabaci）、溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）、銀葉粉虱（B.argentifolii）和紋翅粉虱（T. abutilonea），其中以煙粉虱的傳播能力最為高效（Wintermantel & Wisler，2006）。目前國內(nèi)外暫未獲得ToCV的抗性番茄品種（Orfanidou et al.，2016），又因媒介昆蟲反復(fù)發(fā)生，雜草清理具有難度，導(dǎo)致ToCV防治存在困難。

2016年7月對湖南省蔬菜研究所基地進行病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯的葉片出現(xiàn)褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色等疑似ToCV感染的癥狀，同時在病葉上發(fā)現(xiàn)了大量的煙粉虱。故分別采集癥狀明顯的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片樣品，利用ToCV特異性引物進行分子鑒定，并檢測發(fā)病植株上煙粉虱攜帶ToCV的帶毒率以及煙粉虱的生物類型。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染ToCV的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株葉片各20份，以健康番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片作為陰性對照；以實驗室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片作為陽性對照。采集基地內(nèi)發(fā)病番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株上的煙粉虱，每種植株采集約100頭煙粉虱成蟲。將樣品置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗試劑

TRIzol、氯仿、無水乙醇、ddH2O、RNase-free H2O、限制性核酸內(nèi)切酶（Ase I 酶）、樹脂溶液（10 mg·mL-1）。

1.3 植物總RNA的提取

樣品總RNA的提取采用北京華越洋生物公司多酚多糖植物RNA提取試劑盒，步驟依照試劑盒說明書操作。

1.4 煙粉虱總RNA的提取

煙粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修改。研磨棒充分研磨蟲體后加入1 mL TRIzol振蕩15 s，室溫放置4 min；加入200 μL氯仿，漩渦振蕩30 s，室溫放置3 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心 15 min；移取上清液 500 μL 至新的RNase free離心管中，加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清液，用現(xiàn)配的75%乙醇洗滌沉淀，8 000 r·min-1離心3 min；重復(fù)洗滌1次；棄上清液，8 000 r·min-1離心30 s，小心吸出上清液；室溫晾干3 min，取30 μL RNase-free H2O溶 解， 測 定OD260/OD280值， 檢測RNA的含量和純度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。試驗重?fù)3次。

1.5 cDNA的合成

以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體系步驟參照Vazyme生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書進行：在RNase free離心管中分別加入1 μL RNase-free H2O，4 μL Radom hexamers，3 μL 總 RNA；65 ℃加熱 5 min，迅速置于冰上驟冷，并在冰上靜置2 min；向上一步混合液中加入10 μL 2×RT Mix，2 μL HiscriptⅡ Enzyme Mix；混勻后按照25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RT-PCR和電泳檢測

ToCV的檢測采用ToCV特異性引物ToCV-3（表1）進行PCR擴增。PCR擴增體系為：ddH2O 7 μL，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 μL，ToCV-3R 1 μL（10 μmol·L-1），ToCV-3F 1 μL（10 μmol·L-1），cDNA模板1 μL。PCR程序為：95℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果，產(chǎn)物純化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序分析。

表1 引物信息

1.7 煙粉虱帶毒率的檢測

從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取8頭，采用ToCV特異性引物ToCV-3（表1）進行ToCV檢測，每種植株3次重復(fù)，統(tǒng)計煙粉虱的帶毒率。

煙粉虱帶毒率 = 攜帶ToCV的煙粉虱數(shù)目/ 檢測煙粉虱數(shù)目×100%

1.8 煙粉虱生物類型的鑒定

煙粉虱總DNA的提?。喝? μL蛋白酶K于封口膜上，將每只煙粉虱置于其中研磨成勻漿后移至PCR管中，加入20 μL 10 mg·mL-1的樹脂溶液混勻，然后置于37 ℃孵育1 h，96 ℃ 10 min。

PCR擴增體系為20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，上、下游引物 WT（表 1）各 1 μL（10 μmol·L-1），模板 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 15 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產(chǎn)物取5 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

酶切體系：加入Ase I 0.5 μL，3.1×buffer 2 μL，ddH2O 7.5 μL，與10 μL擴增產(chǎn)物混勻后置于37 ℃ 3～4 h，酶切后取5 μL產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

從每種植株上采集的煙粉虱中隨機選取20頭進行檢測，試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄科蔬菜田間感染ToCV的癥狀

與健康植株相比，田間番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯病株的葉片表現(xiàn)出底部葉片黃化，葉脈濃綠而脈間褪綠黃化，葉片變脆且易折。感病嚴重的植株整株褪綠黃化、果實不能正常膨大，顏色偏白；葉片脈間褪綠黃化，變厚、變脆且易折（圖 1）。

2.2 茄科蔬菜ToCV的發(fā)生率

對4種茄科蔬菜上疑似感染ToCV的樣品進行RT-PCR檢測，擴增出條帶大小為449 bp的特異性條帶，與目標條帶一致（圖2）。對目標條帶純化回收測序后在NCBI上進行比對，結(jié)果顯示與北京番茄ToCV分離物（KC887999.1）部分序列相似度達到99.0%，表明所擴增到的基因片段屬于ToCV的基因序列，確認此次采集的樣品被ToCV感染。檢出率結(jié)果顯示，番茄樣品的ToCV感染率為100%，茄子、辣椒和馬鈴薯樣品的感染率分別為80%、85% 和70%（圖2）。

2.3 煙粉虱體內(nèi)ToCV的帶毒率檢測

收集病葉上的煙粉虱，并進行ToCV的RTPCR檢測，PCR擴增得到條帶大小為446 bp的特異性條帶，與目標片段大小一致（圖3）。從采集的煙粉虱中，每種植株隨機選取8頭進行ToCV帶毒率檢測（表2），番茄上煙粉虱ToCV的平均感染率最高，為87.5%，其次為茄子和馬鈴薯，辣椒上煙粉虱ToCV的平均感染率最低。

圖1 4種茄科作物感染ToCV的癥狀

圖2 4種茄科蔬菜ToCV PCR檢測結(jié)果

2.4 煙粉虱生物類型鑒定

圖3 煙粉虱體內(nèi)ToCV PCR檢測結(jié)果

表2 4種茄科蔬菜上煙粉虱帶毒率統(tǒng)計

圖4 煙粉虱生物類型鑒定結(jié)果

對4種茄科蔬菜上采集的煙粉虱進行生物種群鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA并進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)Ase I消化酶切電泳（圖4），結(jié)果顯示該基地煙粉虱均為MED煙粉虱（Q煙粉虱）。

3 結(jié)論與討論

本試驗采集了湖南省蔬菜研究所基地4種茄科蔬菜植株葉片，利用RT-PCR方法檢測疑似發(fā)病植株葉片感染ToCV的情況，經(jīng)序列分析比對，確認了ToCV已經(jīng)侵染湖南省的茄科作物，證實該病毒已經(jīng)在湖南省發(fā)生。近年來，ToCV對我國以番茄為主的蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重大損失，目前針對ToCV的研究工作主要在其分布、田間診斷和優(yōu)化檢測技術(shù)、致病機理、病蟲互作等方面展開。

2004年Tsai等（2004）在我國臺灣首次發(fā)現(xiàn)ToCV，隨后Zhao等（2013）報道了ToCV在北京的發(fā)生，劉永光等（2014）發(fā)現(xiàn)ToCV在山東暴發(fā)，目前ToCV已在天津（高利利 等，2015）、河北（孫國珍 等，2015）、河南（胡京昂 等，2015）、山西、陜西、浙江、內(nèi)蒙古（鄭慧新 等，2016）、吉林、遼寧（王翠琳 等，2017）、廣東（湯亞飛 等，2017）、海南（Tang et al.，2017）、云南（劉微 等，2018）等地相繼被發(fā)現(xiàn)。近年來國際貿(mào)易的頻繁交流，工廠化苗木調(diào)運可能使感染ToCV的植株進入我國，加之煙粉虱在我國擴散流行，這些原因使得ToCV在我國自沿海向內(nèi)陸迅速蔓延。湖南省周邊省市中目前只有廣東省已經(jīng)報道了ToCV的發(fā)生，由于湖南省蔬菜種植種類眾多，苗木調(diào)運繁雜，這些原因都使得調(diào)查ToCV病毒最初來源的工作巨大且復(fù)雜，因此需要進一步分離純化和鑒定分離物的病毒株系，對比確認其株系來源，從而精準地對ToCV進行防控，同時應(yīng)通過加強對煙粉虱的檢疫檢驗，減少人為因素造成煙粉虱的傳播。

在我國ToCV主要依靠煙粉虱進行傳播。2003年首次在云南省一品紅（Euphorbia pulcherrima）上發(fā)現(xiàn)MED煙粉虱以來（Chu et al.，2006），MED煙粉虱現(xiàn)已遍布全國。目前的研究顯示，與其他煙粉虱相比，MED煙粉虱具有分布廣泛、擴散能力強、繁殖率高、抗藥性強且廣的特點。同時，在我國的大多數(shù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，MED煙粉虱已經(jīng)快速取代 MEAM1煙 粉 虱（Chu et al.，2010；Xi，2010；Xin et al.，2016）。已有研究表明，MED煙粉虱比MEAM1煙粉虱傳播ToCV的能力更強（Shi et al.，2017）。因此，應(yīng)正確識別煙粉虱的生物類型，從而采取正確措施對煙粉虱進行防治，以達到治蟲防病的目的。本試驗中煙粉虱ToCV的帶毒率較高，但由于本試驗采集的樣本數(shù)量較少，后期應(yīng)擴大煙粉虱采集數(shù)量，加強對煙粉虱攜帶ToCV的監(jiān)測。

目前ToCV的防治仍以預(yù)防為主，可以通過選用無病蟲害的幼苗、培育ToCV抗性新品種、田間設(shè)置防蟲網(wǎng)、懸掛粘蟲板、合理換茬，達到早預(yù)防、早控制的效果。目前ToCV的發(fā)生和流行情況日趨嚴重，本試驗首次報道ToCV在湖南省的發(fā)生，表明ToCV有從沿海向內(nèi)陸擴散的趨勢，因此必須提高警惕防止ToCV的進一步蔓延，同時要加強對煙粉虱-ToCV-植物互作的研究，為ToCV的防治和治理奠定理論基礎(chǔ)。