吳曉東，楊 錦，郝云蘭，高曉宇，謝 偉，侯 林，崔海紅，張芳芳

（1.包頭醫(yī)學(xué) 院基礎(chǔ)學(xué)院；2.包頭醫(yī)學(xué)院 麻醉學(xué)院；3.包頭醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；4.內(nèi)蒙古民族大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；5.泰山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)研究所，山東 泰安 271016）

1 引言

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一種體外擴(kuò)增合成特異性DNA片段的方法[1]，擴(kuò)增過(guò)程包括變性、退火以及延伸等反應(yīng)，在經(jīng)多次循環(huán)反應(yīng)后，使得目的基因片段得以快速擴(kuò)增,其具有靈敏度好、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、迅速等特點(diǎn).PCR技術(shù)不但用于基因序列分析、鑒定、擴(kuò)增等基礎(chǔ)研究,而且還可用于多種疾病的基因診斷.

低氧是目前臨床醫(yī)療中常見(jiàn)的病癥，也是各類致死疾病的主要原因[2].研究表明低氧作用具有雙重性，即急性嚴(yán)重的缺氧導(dǎo)致機(jī)體損傷，而適度低氧或低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)機(jī)體有益的保護(hù)作用.這主要取決于低氧的程度和持續(xù)的時(shí)間.因此，這種雙重作用和其調(diào)節(jié)機(jī)制也越來(lái)越受到關(guān)注.而低氧預(yù)適應(yīng)作為機(jī)體抵抗缺氧損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[3]，當(dāng)機(jī)體經(jīng)過(guò)多次短暫、非致死性的低氧刺激后，神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多個(gè)組織對(duì)低氧損傷的耐受性均有增加，這種機(jī)制更傾向于對(duì)機(jī)體的保護(hù)，所以目前該機(jī)制還尚未明確.

BDNF是在腦內(nèi)合成的一種蛋白質(zhì)[4]，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有減少神經(jīng)元損傷和死亡、監(jiān)視神經(jīng)元病理狀態(tài)以及調(diào)控受損神經(jīng)元分化和再生等生物學(xué)功能.研究發(fā)現(xiàn)[5]，急性低氧損傷可造成BDNF其信號(hào)通路的改變.而低氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制是否涉及BDNF仍未有定論.因此，本文通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增低氧小鼠的BDNF基因，來(lái)研究總結(jié)了不同類型低氧即急性低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)BDNF的影響以及對(duì)BDNF信號(hào)通路途徑中發(fā)揮的作用，為后續(xù)低氧研究特別是為低氧機(jī)制研究提供一些要參考.

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 材料及試劑

18g～22g雄性小鼠20只；細(xì)胞裂解液，Thermo公司產(chǎn)品；DNA合成引物，生物工程（上海）有限公司；PCR Mixture，北京康為生物技術(shù)有限公司；DEPC水；瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)；TBE液（MCE公司產(chǎn)品）；苦味酸；其他試劑及器材均由包頭醫(yī)學(xué)院中心試驗(yàn)室提供.

2.1.2 儀器設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（JY98-16）；微量分光光度計(jì)（Nondrop2000）； 低 速 離 心 機(jī) （H1208）； 移 液 槍（Thermo，YM16AA0067439）；冷凍離心機(jī) （Thermo701）；混勻儀（MX-H/RL-O）；振蕩器（8HZ-81）；微波爐（HAIER）；PCR 儀（ARKTIK）；電泳儀（BIO RAD，Wide Mini-Sub Cell GT）；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（Tocan240）等.

2.2 方法

2.2.1 小鼠低氧模型的建立

將實(shí)驗(yàn)雄性小鼠放入250 mL的瓶中，塞緊蓋子，迅速記下起始時(shí)間，觀察小鼠的呼吸狀態(tài).當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠到達(dá)低氧非致死狀態(tài)時(shí)，即小鼠出現(xiàn)仰呼吸急促，急躁，最后出現(xiàn)痙攣.快速拔下蓋子，快速取出實(shí)驗(yàn)小鼠，記錄缺氧時(shí)間，該小鼠為低氧1次，則低氧1次小鼠模型構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)束.繼續(xù)重復(fù)上述步驟4次，取出小鼠后，記錄4次時(shí)間，該小鼠為低氧4次小鼠，則低氧4次小鼠模型構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)束.未低氧直接處死的小鼠記為對(duì)照組.小鼠低氧結(jié)束后，處死并立即剝離小鼠海馬，放入1.5 mL的EP管中，在-80℃的冰箱中凍存.

2.2.2 PCR反應(yīng)

2.2.2.1 引物的合成與設(shè)計(jì) 引物由Invitrogen公司合成，引物基因序列見(jiàn)表1.引物稀釋，5μL上引物加5μL下引物再加90μL dd H2O.

表1 基因引物序列

2.2.2.3 擴(kuò)增及電泳 擴(kuò)增，放入ARKTIK PCR儀中，反應(yīng)條件為預(yù)變性溫度 95℃5min；95℃30s，退火溫度 59℃30s，72℃30s共 40 個(gè)循環(huán)，72℃2min 延伸. 配膠，0.2g～0.4g瓊脂糖凝膠；20ml～40ml TBE液；微波爐加熱至清澈透明；不燙手時(shí)加入一點(diǎn)EB液；倒入電泳槽中；插入木梳；凝膠冷卻30min.電泳，拔出木梳并每空加樣4μL，電泳結(jié)果見(jiàn)圖3.

3 結(jié)果

3.1 基因組DNA的純度與濃度的檢測(cè)結(jié)果

用微量分光光度計(jì)（Nondrop2000）檢測(cè)序列基因DNA的純度和濃度結(jié)果如圖1和表2所示.顯示所檢測(cè)樣品的序列基因DNA紫外吸光值（OD260/280）均在1.80～2.00之間，說(shuō)明DNA的純度和濃度較好，可用于本試驗(yàn)操作.

圖1 核酸濃度曲線

表2 DNA的濃度和純度

3.2 重復(fù)低氧后可以提高小鼠低氧耐受時(shí)間

小鼠缺氧耐受時(shí)間隨著低氧次數(shù)的增加而雙倍增加，即后4次低氧耐受時(shí)間比前1次耐受時(shí)間更明顯（*P＜0.05），可見(jiàn)當(dāng)?shù)脱躅A(yù)適應(yīng)后小鼠的耐受時(shí)間增加了.

圖2 小鼠不同低氧次數(shù)的耐受時(shí)間記錄

3.3 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

應(yīng)用PCR擴(kuò)增BDNF基因電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖 3結(jié)果所示：：①低氧一次小鼠組泳道 2，3，4，5，6，7 并且與對(duì)照組相比條帶亮度增加了，說(shuō)明小鼠急性低氧時(shí)BDNF基因表達(dá)增加了②低氧四次小鼠組泳道 8，9，10，11，12 擴(kuò)增出BDNF基因并且與對(duì)照組相比條帶亮度減少了，說(shuō)明小鼠低氧預(yù)適后BDNF基因表達(dá)降低了③急性低氧時(shí)小鼠可能通過(guò)表達(dá)BDNF基因，對(duì)其神經(jīng)損傷起到了修復(fù)作用，而隨著小鼠對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)這種保護(hù)機(jī)制出現(xiàn)了降低趨勢(shì)，這有待于我們繼續(xù)去研究.

圖3 PCR擴(kuò)增BDNF基因電泳檢測(cè)結(jié)果

3 討論

PCR技術(shù)具有快速簡(jiǎn)便檢測(cè)目的基因的效果[6]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PCR擴(kuò)增結(jié)果可知低氧預(yù)適應(yīng)小鼠可能是過(guò)表達(dá)了BDNF基因，從而對(duì)其神經(jīng)損傷起到了修復(fù)作用，而急性低氧小鼠對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)這種修復(fù)作用出現(xiàn)了降低趨勢(shì).近期研究也發(fā)現(xiàn)[7]，急性低氧與低氧預(yù)適應(yīng)都可能通過(guò)調(diào)控BDNF的表達(dá)，從而影響腦的結(jié)構(gòu)和功能，但是激活下游途徑的機(jī)制不同，產(chǎn)生的結(jié)果也不相同.當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，BDNF在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)生存和死亡的過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8].通過(guò)檢測(cè)缺氧對(duì)BDNF表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)急性缺氧處理后，其能夠調(diào)控BDNF在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)，進(jìn)而神經(jīng)細(xì)胞的損傷.Tian的小鼠低氧實(shí)驗(yàn)通過(guò)低氧刺激誘導(dǎo)BDNF和TrkB受體的表達(dá)也證實(shí)了二者在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[9].另外，將神經(jīng)細(xì)胞置于24小時(shí)常氧和急性低氧情況下同時(shí)培養(yǎng)，BDNF與在急性低氧條件下的結(jié)合明顯減少[10].研究還表明，BDNF誘導(dǎo)啟動(dòng)子的活性增加，可能是啟動(dòng)了相關(guān)缺氧反應(yīng)元件的突變[11].Scott等研究發(fā)現(xiàn)[12]，當(dāng)BDNF作用于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞TrkB受體（AMC）時(shí)，低氧預(yù)適應(yīng)組、暴露在急性缺氧組和正常對(duì)照組三者相比，其AMC的TrkB受體興奮性升高，細(xì)胞內(nèi)BDNF和兒茶酚胺的分泌也明顯增加.TrkB通過(guò)與配體BDNF結(jié)合，在后期低氧損傷的神經(jīng)元中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[13].小鼠低氧預(yù)適應(yīng)時(shí)可以刺激神經(jīng)細(xì)胞中的BDNF表達(dá)上調(diào)，這為我們后期的相關(guān)機(jī)制的研究具有重要的參考價(jià)值.

5 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，隨著低氧神經(jīng)保護(hù)作用研究的不斷深入，已經(jīng)逐漸發(fā)現(xiàn)了低氧具有雙重作用，既可能產(chǎn)生損傷，又可產(chǎn)生對(duì)機(jī)體有益的保護(hù)作用，這主要取決于低氧的程度和持續(xù)的時(shí)間，以及激活反應(yīng)體系不同而論.隨著低氧對(duì)BDNF作用機(jī)制中的一些新的信號(hào)蛋白和信號(hào)通路的發(fā)現(xiàn)，其機(jī)制也越來(lái)越受到關(guān)注.本文應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了低氧小鼠BDNF基因，歸納了腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)研究方面的最新進(jìn)展，低氧后對(duì)小鼠低氧耐受時(shí)間進(jìn)行了分析.除此之外，還分別對(duì)急性低氧和低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)BDNF的影響和表達(dá)進(jìn)行了更新.然而，到目前為止，低氧損傷與低氧預(yù)適應(yīng)對(duì)BDNF及其信號(hào)通路的具體影響機(jī)制還有待我們進(jìn)一步探究.