崔勝金 陳澤衍 郭偉權(quán) 周義文

(南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院 深圳 518101)

肥胖相關(guān)性腎病是臨床常見的腎病類型，各年齡段均可發(fā)病，青壯年多發(fā)，相關(guān)數(shù)據(jù)顯示70%患者發(fā)病年齡在44歲以下，且男性患者發(fā)病率略高于女性，患者患病后除了有明顯蛋白尿，同時存在腎小球肥大或硬化情況[1～2]。目前臨床主要通過藥物改善患者腎臟功能、控制病情發(fā)展，近幾年臨床一直在研究疾病發(fā)病機制，希望從中找到防治疾病的靶點，并通過藥物靶點作用達到治療效果。miR是一種RNA在生物體的器官形成、細胞增殖、凋亡及部分疾病的發(fā)生中發(fā)揮作用[3]。在相關(guān)研究中miR-192在腎臟組織中高表達，且糖尿病腎病(DA)者纖維化腎小球中miR-192表達水平顯著低于無纖維化組織，其認為miR-192可能參與DA發(fā)病，故臨床認為miR可能在腎病發(fā)生中發(fā)揮作用。CTNNBIPl是一種結(jié)合蛋白，有研究表明其使信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵分子，能與Tcf/fLef轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄共激活子CPB/p300競爭性地與β-catenin結(jié)合，從而調(diào)控相關(guān)信號途徑。本文通過觀察db/db小鼠腎組織中miR-215表達，查詢其調(diào)控的靶基因，證實其與靶基因的關(guān)系，觀察靶基因表達，從而分析miR在疾病發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1實驗試劑

miR-215模擬物及對照，羊抗ICAT抗體(CTNNBIP1)，Cy3標記的miR陰性對照，小鼠抗β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的抗羊IgG和抗生物素-辣根過氧化物酶抗體，實時定量 PCR試劑盒、熒光素酶報告基因載體pmiR-REPORT質(zhì)粒等。

1.1.2實驗物

雄性小鼠36只(實驗動物中心提供 SPF級)，其中db/m小鼠、db/db小鼠各18只，且均為4周齡。

1.2 方法

1.2.1實驗物處理

兩組小鼠均于SPF清潔級層流室中飼養(yǎng)，小鼠可自由進食、進水，于小鼠8、12、16周齡時，隨機在兩組各抽6只處死，開腹取出腎臟，清除腎門處血管等結(jié)締組織，將腎組織以液氮保存。

1.2.2miR-215靶基因預測

使用Targetscan、Pictar及和miRNA.org預測軟件對miR-215靶基因進行預測，找出3個軟件預測交集的靶基因，并通過過GO注釋分析靶基因的生物學功能，進而找出相關(guān)靶基因。

1.2.3構(gòu)建miR-CTNNBIPl-3'UTR質(zhì)粒

參考Targetscan軟件中CTNNBIPl-3'UTR序列，以Primer Premier0軟件對成PCR引物進行設計合成，將限制性內(nèi)切酶SpeI(ACTAGT)與HindⅢ(AAGCTT)識別位點分別加入上、下游引物中，序列為5'-GCGCACTAGTTCTTGACCAACGGAAAC-3'，5'-GCGCAAGCTTACCTACAGCCAATCAAAG-3'。提取培養(yǎng)MMC RNA，并在反轉(zhuǎn)錄后將可能與miR-215序列結(jié)合的位點片段，行CTNNBIPl-3'UTR PCR擴增，擴增后與Spe I與Hind Ⅲ雙酶切pmiR-REPORT載體相連。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，提取質(zhì)粒，并以Spe I、HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒進行克隆測序，選擇其中測序正確的質(zhì)粒，完成miR-CTNNBIPl-3'UTR質(zhì)粒的構(gòu)建。

1.2.4測雙熒光素酶活性

對細胞進行培養(yǎng)，選擇處于對數(shù)生長期細胞接種，在細胞密度達到50%～70%后行基因轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染劑分別加入4組中，1組(pmiR-REPORT+pRL-TK質(zhì)粒+miR-control)、兩組(pmiR-REPORT+pRL-TK質(zhì)粒+miR-215 mimics)、3組(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK質(zhì)粒+miR-control)、4組(pmiR-CTNNBIPl-3'UTR+pRL-TK質(zhì)粒+miR-215 mimics)，轉(zhuǎn)染1d后測酶活性，以螢火蟲與海腎熒光活性的比值表示相對熒光素酶活性。

1.2.5PCR法

小鼠腎臟組織RNA提取按照Trizol說明書行腎組織RNA提取，應用超微量分光光度計測定核酸濃度，取等量0.5μl RNA按試劑盒說明書行反轉(zhuǎn)錄，以采用PCR系統(tǒng)行實時熒光定量PCR反應，結(jié)束后行熔解曲線分析，確定PCR擴增特異性，得出的ct值并按公式求出基因表達的相對變化量，重復3次。

1.2.6Westernblot法

根據(jù)SP免疫組織化學檢測試劑盒說明書進行操作，以PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 觀察指標

觀察兩組小鼠小鼠腎組織中miR-215、CTNNBIPl的表達變化情況。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組miR-215、CTNNBIPl水平表達

結(jié)果顯示觀察組小鼠隨著周齡增加組織中miR-215表達上升，P<0.05；對照組無明顯變化，同時隨著周齡增加觀察組CTNNBIPl表達下降，P<0.05，見圖1。

2.2 miR-215、CTNNBIPl的關(guān)系

結(jié)果顯示4組熒光素酶相對活性低于其他3組，4組熒光表達強度低，P<0.05，見圖2。

圖2 熒光素酶活性

3 討論

miR是一類具有高度保守表達的新型RNA片段，其通過與基因mRNA的3'-UTR堿基互補配對結(jié)合，從而對基因mRNA特性進行降解，進而參與調(diào)控下游靶基因表達，臨床認為通過對這些能特異性表達的miR進行分析，能對一些疾病防治起到重要作用[5]。肥胖相關(guān)性腎病是臨床一種因患者肥胖所引發(fā)的腎臟疾病，特征為持續(xù)性蛋白尿、腎小球濾過率增高，疾病可致患者腎小球病變(單純肥大、硬化)，若不及時治療患者預后較差，5 年腎存活率僅為77%，10 年為51%，因此如何有效防治疾病得到臨床的重視[6]。

早前有學者發(fā)現(xiàn)miR-192在腎臟組織中能特異性表達，其通過調(diào)控靶基因SIPl、ZEBI表達，來參與腎小球系膜細胞細胞外基質(zhì)的過度積聚的過程，其水平高度表達有促腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化的作用[7]。miR-215與miR-192具有共同的“種子序列”，故推測其可能具有與miR-192相似的病理作用，本次結(jié)果顯示小鼠肥胖相關(guān)性腎病形成過程中，觀察組腎組織miR-215表達上升，呈明顯的時間依賴性，且與對照組miR-215表達有明顯差異，提示miR參與肥胖相關(guān)性腎病的形成[8]。同時通過用生物信息學分析，其相關(guān)調(diào)控靶基因為CTNNBIPl，CTNNBIPl是一種結(jié)合蛋白，有研究表明其是信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵分子，能通過競爭性地與β-catenin結(jié)合，對Wnt-β-catenin信號途徑進行負性調(diào)控，而Wnt-β-catenin途徑下游靶基因與腎小球纖維化機制、系膜細胞表型轉(zhuǎn)化的啟動、維持密切相關(guān)，故臨床認為miR可能通過調(diào)節(jié)CTNNBIPl來參與疾病的發(fā)生、發(fā)展[9]。

本次結(jié)果顯示隨著周齡增加觀察組CTNNBIPl表達下降，且與對照組CTNNBIPl表達有明顯差異，同時雙熒光素酶實驗顯示。轉(zhuǎn)染miR-215可抑制基因熒光素酶的表達活性，提示CTNNBIPl的表達受到miR-215負性調(diào)控，隨著miR-215表達上調(diào)，CTNNBIPl表達逐漸下降，從而使肥胖性腎病患者病程中Wnt-β-catenin途徑處于激活狀態(tài)，進而促纖維細胞因子表達，臨床表現(xiàn)為腎小球的逐漸硬化[10]。

綜上所述，miR-215可能通過調(diào)控CTNNBIPl靶基因表達，從而參與肥胖相關(guān)性腎病的形成，本實驗結(jié)果仍有待進一步深入研究，若得到證實miR-215可能成為早期疾病診斷、判斷預后的有效標志物。