賈俊強,陳 煉,吳瓊英,3,桂仲爭,3

(1.江蘇科技大學 糧食學院，鎮(zhèn)江 212004) (2.江蘇科技大學 生物技術學院,鎮(zhèn)江 212018) (3.中國農(nóng)業(yè)科學院 蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江212018)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris),又名北冬蟲夏草,是一種珍貴藥用真菌．蛹蟲草含有多糖、蟲草素、蟲草酸、腺苷和超氧化物歧化酶等生物活性成分,其中多糖含量高達8.15%[1],為蛹蟲草的主要活性物質(zhì)之一．現(xiàn)代藥理學研究表明,蛹蟲草多糖的生物活性十分廣泛,包括抗氧化作用[2]、調(diào)節(jié)免疫作用[3]和抗腫瘤作用[4]等,具有良好的開發(fā)潛力和應用前景．

多糖的構效關系表明,多糖的生物活性主要取決于其分子結(jié)構,包括單糖組成、分子量、主鏈和支鏈的結(jié)構、溶解度和溶液中構象等[5]．化學修飾可以通過改變多糖分子結(jié)構特征提高多糖的生物活性,現(xiàn)已成為開發(fā)高活性多糖衍生物的主要方法[6]．文獻[7]利用乙酰化修飾提高了金耳多糖對小鼠脾淋巴細胞的免疫刺激活性;文獻[8]利用羧甲基化修飾提高了灰樹花胞外多糖的體外抗氧化活性和抗腫瘤活性．然而,利用化學修飾改善蛹蟲草多糖生物活性的研究較少,特別是化學修飾后蛹蟲草多糖清除DPPH自由基、螯合Fe2+和抗腫瘤等的研究尚未見報道．文中擬對蛹蟲草多糖分別進行硫酸化、磷酸化和乙?；揎?探討修飾后蛹蟲草多糖的清除DPPH自由基活性、螯合Fe2+能力和抑制人胃癌SGC7901細胞增殖活性,以期為蛹蟲草多糖的進一步開發(fā)利用提供理論指導．

1 實驗

1.1 材料和試劑

蛹蟲草由中國農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)研究所蠶桑資源功能利用研究室提供,將蛹蟲草在60℃干燥后粉碎,過100目篩備用．

DEAE-Cellulose-52樹脂(Whatman分裝),購于上海奧宇生物有限公司;菲洛嗪和1,1-二硝基-2-三硝基苯肼(DPPH)購于Sigma-Aldrich公司;噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基和胰酶購于Gibco公司;乙醇、N-溴代琥珀酰亞胺、濃硫酸、硫酸銨、甲酰胺、正丁醇、乙酰酐、正丁胺、多聚磷酸、葡萄糖和苯酚等均為分析純,購于國藥集團化學試劑有限公司．

1.2 實驗儀器

JJ-1精密定時電動攪拌器(金壇市榮華儀器制造有限公司);Sartorius電子精密天平(德國賽多利斯股份公司);RE-52D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠); DHL-A電腦恒流泵(上海滬西分析儀器有限公司);DBS-160電腦全自動部份收集器(上海滬西分析儀器有限公司);Multifuge X1R 離心機(Thermo Fisher Scientific公司);UV-2450紫外可見光分光光度計(日本島津公司);FDU-2100冷凍干燥機(上海愛朗儀器有限公司);2300-2型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Sheldon公司);XDS-1B型倒置式顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);S4800-II場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日立高新技術國際貿(mào)易有限公司)．

1.3 實驗方法

(1) 蛹蟲草多糖的提取與純化

將蛹蟲草粉末配制成23.2 mg/mL懸浮液,利用超聲波在103 W輔助提取39.8 min,在3 000 r/min離心10 min,收集上清液后用Sevag法脫蛋白[9],然后在80%乙醇濃度下沉淀多糖,收集多糖后復溶于蒸餾水,透析2～3 d,冷凍干燥得蛹蟲草粗多糖;將得到的粗多糖利用DEAE-Cellulose-52陰離子交換樹脂進行純化,利用0～0.3 mol/L NaCl進行梯度洗脫,洗脫流速為1 mL/min,每10 min收集一管,然后利用苯酚-硫酸法[10]檢測每管收集液的多糖含量,收集多糖含量最高的洗脫組分,透析后冷凍干燥．

(2) 蛹蟲草多糖的乙?；揎?/p>

取2.0 g多糖溶于80 mL甲酰胺中，在80 ℃下持續(xù)攪拌30 min,加入50 mL乙酸酐和1% N-溴代琥珀酰亞胺．在80℃持續(xù)攪拌反應6 h,加入20 mL蒸餾水,冷卻至室溫,加入75%乙醇沉淀多糖．沉淀洗滌后溶于100 mL蒸餾水用NaOH溶液調(diào)至pH7.0,用透析袋透析72 h,經(jīng)濃縮、冷凍干燥后即得到乙?；枷x草多糖,按下式計算乙酰化蛹蟲草多糖的取代度[11]．

DS=1.62Ac/(43-0.42Ac)

式中：DS為取代度;Ac為乙?；?，%．

(3) 蛹蟲草多糖的磷酸化修飾

取2.0 g多糖溶于100 mL甲酰胺中,加入10 mL三丁基胺,5.0 g多聚磷酸,室溫攪拌24 h,乙醇沉淀．離心收集沉淀并溶于100 mL蒸餾水,用NaOH調(diào)至pH10,在37℃真空蒸發(fā)掉釋放的三丁基胺,透析袋透析濃縮、過濾,濾液中加入0.2 g乙酸鈉,用乙醇沉淀,沉淀用乙醇洗滌多次后冷凍干燥,按下式計算磷酸化蛹蟲草多糖的取代度[12]．

DS=1.62P/(31-1.24P)

式中：DS為取代度;P為乙?；浚?．

(4) 蛹蟲草多糖的硫酸化修飾

分別取48 mL濃硫酸和12 mL正丁醇加入帶干燥管和攪拌裝置的三頸燒瓶中．再加入0.5 g硫酸銨,攪拌后冰浴冷卻至0℃．緩慢加入2.0 g多糖粉末,反應4 h左右．反應結(jié)束后用NaOH調(diào)整溶液pH至8.0．透析袋透析72 h后,冷凍干燥,按下式計算硫酸化蛹蟲草多糖的取代度[13]．

DS=1.62S/(32-1.02S)

式中：DS為取代度;S為乙?；?，%．

(5) 掃描電子顯微鏡觀察

多糖樣品冷凍干燥后制成粉末,然后粘貼在導電雙面膠上,在樣品涂層上噴10 nm金,用掃描電子顯微鏡在15 kV電壓下進行掃描．

(6) 抗氧化活性分析

清除DPPH自由基活性: 取2 mL樣品溶液與2 mL 0.04 mol/L DPPH溶液(用95%乙醇配制)混合后,室溫反應30 min后在517 nm處測定吸光值,DPPH自由基清除率按下式計算[14]．

DPPH自由基清除率(%)=[C-(S-B)/C]×100

(1)

式中：S為樣品與 DPPH反應后的吸光值；B為樣品與95%乙醇混合后的吸光值；C為95%乙醇與DPPH混合后的吸光值．利用IC50值表示樣品清除DPPH自由基的活性,IC50值通過樣品濃度與清除率之間的回歸方程確定．

螯合Fe2+能力: 取3 mL樣品溶液與0.05 mL 5.0 mmol/L FeCl2溶液混合,然后迅速添加0.1 mL 5.0 mmol/L 菲咯嗪溶液開始反應,室溫下反應10 min后在562 nm處測吸光值, Fe2+螯合率按下式計算[14]．

Fe2+螯合率(%)=[(A0-A1)/A0]×100

(2)

式中：A0為空白組(蒸餾水代替樣品)的吸光值；A1為樣品組的吸光值．利用IC50值表示樣品螯合Fe2+的能力,IC50值通過樣品濃度與螯合率之間的回歸方程確定．

(7) 抗腫瘤活性分析

腫瘤細胞的培養(yǎng):將腫瘤細胞(人胃癌SGC7901細胞)接種培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中, 在37℃和5% CO2濃度下進行培養(yǎng)．

抗腫瘤活性分析:將腫瘤細胞(4×103個/孔)接種在96孔板中,在37℃和5% CO2濃度下培養(yǎng)12 h后,分別加入100μL質(zhì)量濃度為100、200、300、400、500和600 μg/mL的多糖樣品(以PBS為對照),培養(yǎng)48 h后,每孔加入100 μL濃度為1 mg/mL MTT,在37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液,分別在各孔中加入100 μL DMSO,37℃振蕩孵育10 min,在570 nm下測定吸光值,每組實驗重復3次,按下式計算多糖的抗腫瘤活性[15]:

抑制率(%)=(1-A1/A0)×100

(3)

式中：A0為對照組的吸光值;A1為樣品組的吸光值．利用IC50值表示樣品的抗腫瘤活性,IC50值通過樣品濃度與抑制率之間的回歸方程確定．

2 結(jié)果與討論

2.1 蛹蟲草多糖的分離及紫外光譜分析

蛹蟲草多糖經(jīng)Sevag法反復脫蛋白后的紫外掃描光譜見圖1．由圖1可知,脫蛋白后的蛹蟲草多糖在280 nm左右仍然有輕微的吸收峰,這說明蛹蟲草多糖是一種多糖-蛋白質(zhì)復合物．現(xiàn)有研究表明,多糖分子中的蛋白質(zhì)含量與其抗腫瘤活性密切相關[16]．因此,蛹蟲草多糖的生物活性可能部分歸因于含有少量蛋白質(zhì)．為了對蛹蟲草多糖進行化學修飾,采用DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂對脫蛋白蛹蟲草多糖進行分離純化(圖2),共得到F1和F2兩個組分,收集主要組分F2進行化學修飾．

圖1 蛹蟲草多糖的紫外光譜Fig.1 Ultraviolet spectrum of polysaccharide from Cordyceps militaris

圖2 蛹蟲草多糖的DEAE-52纖維素陰離子交換色譜Fig.2 Anion-exchange chromatogram of polysaccharide from Cordyceps militaris on DEAE-52 cellulose column

2.2 蛹蟲草多糖取代度分析及其晶體表面形態(tài)觀察

將純化的蛹蟲草多糖分別進行乙?；?、磷酸化和硫酸化修飾,修飾后蛹蟲草多糖的取代度如圖3．由圖3可知,蛹蟲草多糖的乙?；〈?0.96)最高;磷酸化和硫酸化的取代度基本一致(約0.40)．掃描電子顯微鏡觀察表明(圖4),蛹蟲草多糖修飾前的聚集體顆粒較小,呈較規(guī)則的短棒狀結(jié)構,且緊密簇擁在一起;蛹蟲草多糖經(jīng)乙?；揎椇?其聚集體結(jié)構呈片狀,分層緊密排列,聚集體顆粒明顯增大,表面光滑;蛹蟲草多糖經(jīng)磷酸化修飾后,聚集體顆粒變得不規(guī)則,表面粗糙不光滑;蛹蟲草多糖經(jīng)硫酸化修飾后,聚集體顆粒變大,呈片狀,表面略顯光滑,但較乙?；枷x草多糖聚集體表面粗糙.這表明蛹蟲草多糖經(jīng)化學修飾后聚集體表面形態(tài)發(fā)生明顯變化,而這些變化可能與多糖分子修飾后空間結(jié)構發(fā)生改變有關．

圖3 不同化學修飾下蛹蟲草多糖的取代度Fig.3 Degree of substitution of polysaccharide from Cordyceps militaris after different chemical modifications

圖4 不同化學修飾后蛹蟲草多糖的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron micrographs of polysaccharide from Cordyceps militaris after different chemical modificationss

2.3 化學修飾對蛹蟲草多糖體外抗氧化活性影響

由圖5可知,乙酰化和硫酸化修飾能夠提高蛹蟲草多糖清除DPPH自由基活性,分別使其活性提高了29.1%和11.9%,然而,磷酸化修飾導致了蛹蟲草多糖清除DPPH自由基活性降低了36.4%．在這3種化學修飾多糖中,乙?；枷x草多糖清除DPPH自由基活性最高．文獻[17]研究乙酰化修飾靈芝多糖時認為,在多糖分子中引入乙?；鶊F能夠有效提高其清除DPPH自由基活性，這與文中的研究結(jié)果一致．

由圖6可知,蛹蟲草多糖經(jīng)磷酸化和硫酸化修飾后,螯合Fe2+能力顯著提高,分別比修飾前提高了37.7%和47.2%．然而,乙?；揎棇τ枷x草多糖螯合Fe2+能力基本無影響．在這3種化學修飾多糖中,硫酸化蛹蟲草多糖螯合Fe2+能力最強,這主要是因為硫酸根基團使多糖端基碳的氫原子活潑,增加多糖聚合電解質(zhì)和親核性,提高了與鐵離子的接觸與結(jié)合能力[18]．

綜上所述,硫酸化修飾不僅提高了蛹蟲草多糖清除DPPH自由基活性,同時也提高了蛹蟲草多糖螯合Fe2+能力,是提高蛹蟲草多糖抗氧化活性最理想的方法．

圖5 化學修飾對蛹蟲草多糖清除DPPH自由基活性影響Fig.5 Effect of chemical modification on scavenging DPPH radical activity of polysaccharide from Cordyceps militaris

圖6 化學修飾對蛹蟲草多糖螯合Fe2+能力影響Fig.6 Effect of chemical modification on chelating Fe2+ capacity of polysaccharide from Cordyceps militaris

2.4 化學修飾對蛹蟲草多糖體外抗腫瘤活性影響

蛹蟲草多糖經(jīng)化學修飾后對SGC7901細胞增殖的抑制活性見圖7．由圖7可知,硫酸化修飾能夠顯著提高蛹蟲草多糖抑制SGC7901細胞的增殖,其抑制活性提高了47.0%;磷酸化修飾和乙?；揎棽⒉荒芴岣哂枷x草多糖抑制SGC7901細胞增殖活性,反而使其活性分別降低了35.5%和68.8%．硫酸化蛹蟲草多糖抑制SGC7901細胞增殖活性(48 h的IC50為0.170 mg/mL)要遠遠高于硫酸化灰樹花多糖(48 h的IC50為0.264 mg/mL)[19],具有良好的預防和治療人胃癌疾病的潛力．大量研究表明,硫酸化修飾能夠有效提高多糖的抗腫瘤活性;文獻[19]用硫酸化修飾提高了灰樹花多糖抑制SGC7901細胞增殖活性;文獻[20]研究發(fā)現(xiàn),天然茯苓菌核多糖沒有抑制SGC7901細胞增殖活性,但當多糖分子中引入硫酸酯基后,其表現(xiàn)出良好的抑制SGC7901細胞增殖活性,在硫酸化茯苓菌核多糖5 g/L濃度時抑制SGC7901細胞增殖活性達到36.7%．硫酸化多糖的抗腫瘤活性歸因其良好的自由基清除活性,能夠有效阻止由氧自由基引起的細胞氧化應激反應[21-22]．

圖7 化學修飾后蛹蟲草多糖的SGC7901細胞抑制活性Fig.7 Inhibition activities of Cordyceps militaris polysaccharide on SGC7901 cells after chemical modification

3 結(jié)論

(1) 蛹蟲草多糖是一種含有少量蛋白質(zhì)的多糖,化學修飾改變了蛹蟲草多糖聚集體的表面形態(tài);蛹蟲草多糖乙酰化的取代度為0.96,它的磷酸化和硫酸化取代度基本相似,約為0.40．

(2) 與乙?；揎椇土姿峄揎椣啾?硫酸化修飾不僅提高了蛹蟲草多糖清除DPPH自由基活性及螯合Fe2+能力,而且提高了蛹蟲草多糖抑制SGC7901細胞增殖活性,是一種改善蛹蟲草多糖生物活性的有效方法．