廣澤宇

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東 煙臺 264003）

植物病害一直在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有較大影響，化學(xué)防治是控制植物病害的有效方法，其具有見效快、殺菌譜廣、成本低、使用簡便等優(yōu)點［1］，但長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥致使病原菌產(chǎn)生了耐受性，并且農(nóng)藥對人、畜和環(huán)境都有一定的危害。隨著近年來人們對食品安全及環(huán)境污染問題關(guān)注度的提高，一些化學(xué)殺菌劑在許多發(fā)達國家和地區(qū)已被嚴格限制使用［2］。生物防治技術(shù)是一種無殘留無污染、不殺傷天敵、不會產(chǎn)生抗藥性［3］、有利于人畜安全及環(huán)境保護的無公害環(huán)保技術(shù)，有利于提高經(jīng)濟、社會、生態(tài)效益，有廣闊的發(fā)展前景［4］。因此，生物防治尤其是微生物防治在將來可能替代化學(xué)藥劑成為一個環(huán)保安全的選擇［5］。

本研究旨在從植物根際土壤中分離篩選對植物病原微生物具有生防作用的芽孢桿菌，對其進行鑒定。分離篩選出高效生防的芽孢桿菌，為以后拮抗型生物肥料以及生物農(nóng)藥的生產(chǎn)提供高效的菌種，同時為菌種的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供科學(xué)的試驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物病原菌株。立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、葫蘆科刺盤孢Colletotrichumlagenarium、灰葡萄孢（Botrytiscinerea）、玉蜀黍離蠕孢（Bipolarismaydis）、鏈格孢（AlternariaNees）、尖孢鐮刀（Fusariumoxysporum）、腐皮殼霉（Fusariumsolani）、交鏈孢霉（Alternaria sp.），試驗室保藏。

1.1.2 主要試劑NA。固體培養(yǎng)基、NB液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、FastDNA?SPINKitfor SoilDNA試劑盒，Trans2KPlusⅡ DNAMarker、6×DNA LoadingBuffer、Agarose、50×TBE。

1.1.3 儀器設(shè)備。生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、霉菌培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、立式壓力蒸汽滅菌鍋（北京柏萊斯特科技發(fā)展有限公司）、核酸蛋白檢測儀（北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）以及梯度PCR儀（上海拜力生物科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤中芽孢桿菌的分離與純化。從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院校內(nèi)菜地采集土樣，陰干研磨后稱取10g，放入100mL無菌水于250mL三角瓶中，搖動3～5min，在80℃水浴中加熱10min［6］。梯度稀釋涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)48h。挑取單菌落、鏡檢，根據(jù)單菌落大小、表面結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、光澤和顏色等特征，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落，采用劃線分離的方法純化，將已純化的菌株保存于NA培養(yǎng)基斜面?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 拮抗菌株的篩選。對分離純化到的芽孢桿菌，以供試病原真菌為靶標(biāo)，采用平板對峙培養(yǎng)法［8］，用皿內(nèi)瓊膠平板直接測定。逐日觀察菌落的生長和細菌的抑制作用，選擇拮抗性好的菌株進入復(fù)篩。以初篩結(jié)論為基礎(chǔ)，在PDA平板中心先接種病原菌，一兩天后在四周接種同一種芽孢桿菌菌株，兩者相距5cm，3次重復(fù)，分別以細菌和病原菌在PDA上的純培養(yǎng)為對照，28℃培養(yǎng)，逐日觀察菌落的生長和細菌的抑制作用，篩選生長速度快、抑制率高的菌株。

1.2.3 生防芽孢桿菌優(yōu)良菌株的初步鑒定

1.2.3.1 培養(yǎng)特征的觀察。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［9］中的形態(tài)學(xué)指標(biāo)，將菌株分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，倒置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，觀察生防菌株在培養(yǎng)基上的菌落的生長情況。

1.2.3.2 菌體形態(tài)的觀察。挑取在斜面培養(yǎng)48h的生防芽孢桿菌菌落于載玻片上，分別進行革蘭氏染色、芽孢染色、及莢膜染色，并在顯微鏡下觀察拮抗菌的大小和形態(tài)。

1.2.3.3 16SrRNA基因的擴增與測序。將菌種接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃溫度，200r/min過夜培養(yǎng)，12000r/min離心收集菌體，用FastDNATMSPINKitfor Soil試劑盒提取細菌基因組DNA。使用細菌16SrDNA通過引物27F和1492R對提取的基因組DNA進行PCR擴增［10］。PCR產(chǎn)物送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.3.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。根據(jù)16sSrRNA測序結(jié)果，登陸NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列相似性比對搜索，從中獲得相似性較高的典型菌株序列作為參比對象，用MEGA8.0生物軟件進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗芽孢桿菌的分離篩選

本試驗共分離純化芽孢桿菌33株，經(jīng)平板對峙試驗篩選出對病原菌具有拮抗作用的菌株6株，其中菌株B-Q4對立枯絲核菌、玉蜀黍離蠕孢、腐皮殼霉、交鏈孢霉均具有良好的拮抗作用，確定為最優(yōu)菌株（如圖1所示）。

2.1.1 培養(yǎng)特征觀察結(jié)果。B-Q4在NA培養(yǎng)基平板上菌落為圓形或近圓形，直徑5mm，乳白色，質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質(zhì)，邊緣不整齊（如圖2所示）。

圖2 菌株在平板上的菌落特征

2.1.2 菌體形態(tài)觀察結(jié)果。B-Q4菌體呈短桿狀，在電子顯微鏡下大小為（1.0～1.2）μm×（3.0～4.0）μm，培養(yǎng)48h后產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，中生或近中生，1.0～1.5μm，孢囊無明顯膨大。革蘭氏陽性，無莢膜（如圖3所示）。

圖3 B-Q4菌體形態(tài)（電子顯微鏡下）

2.2 基因組DNA的提取及16SrDNAPCR擴增

利用FastDNATMSPINKitforSoil試劑盒提取的細菌基因組DNA，經(jīng)過PCR擴增，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（如圖4所示），獲得了約1500bp的條帶。

圖4 PCR產(chǎn)物電泳圖譜

注：M為Trans2KPlusⅡDNAMarker分子量標(biāo)準1為B-Q416SrDNAPCR擴增產(chǎn)物。

2.3 16SrDNA序列分析比對結(jié)果

以B-Q4基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到的特異16SrDNA片段長度為1434bp（如圖5所示），將B-Q4菌株的16SrDNA測序結(jié)果在NCBI中進行Blast比對，結(jié)果表明，B-Q4菌株與BacilluscereusSP31的序列相似性達到99%，通過MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示菌株B-Q4都與Bacilluscereus親緣關(guān)系最近。

圖5 特異16SrDNA片段長度

3 結(jié)論

本試驗對B-Q4菌株進行了分子鑒定及其生物學(xué)特性的研究。通過16SrDNA序列分析，對B-Q4進行分子鑒定，結(jié)果表明，B-Q4為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。B-Q4在NA培養(yǎng)基平板上菌落為圓形或近圓形，乳白色，質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤，表面有褶皺，蠟質(zhì)，邊緣不整齊；在斜面上劃線培養(yǎng)呈直線生長；在液體培養(yǎng)基中生長，液體混濁具有菌膜。其形態(tài)學(xué)研究進一步說明B-Q4是蠟樣芽孢桿菌。

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