楊 佩 許 斌 孫清江

(東南大學生物科學與醫(yī)學工程學院, 南京210096)(東南大學生物電子學國家重點實驗室, 南京210096)

碳量子點或碳點是一種新型零維碳納米材料，其尺寸小于10 nm．Xu等[1]在分離與提純單層碳納米管時首次發(fā)現(xiàn)了碳量子點．碳量子點具有優(yōu)良的光化學性能、良好的生物相容性、低毒性和易于表面修飾等優(yōu)點，因此在生物成像、生物傳感器以及納米載體等方面有著廣泛的應用[2-4]．通常碳量子點表面擁有不同的功能團，例如，羧基、羥基以及氨基等[5]，表面基團單一性有利于碳量子點進行化學修飾和生物偶聯(lián)，通過不同的方法可以實現(xiàn)碳量子點表面基團的單一化，如：通過聚乙烯亞胺(PEI)可合成富含氨基的碳量子點[6]，利用氯乙酸鈉(ClCH2COONa)可制備得到富含羧基的碳量子點[7]．這些基團不但使碳量子點具有很好的水溶性，同時也有利于具有生物功能的分子對碳量子點的功能化[8]．

近年來，作為新一代的診療技術，“精準醫(yī)療”由于其準確性和快捷性的特點在生物醫(yī)學領域得到了廣泛關注[9]．碳量子點經(jīng)生物功能化后，不僅擁有碳點本身的優(yōu)異的熒光、物理和化學性質，還能具有特定生物功能，如癌細胞靶向和細胞核靶向等能力．這些功能可極大地擴展碳點在生物醫(yī)學領域中的應用，實現(xiàn)細胞內(nèi)靶向藥物運輸以及特定位置的熒光成像分析．碳量子點尺寸一般在10 nm以下，非常易于進入細胞內(nèi)，但對細胞內(nèi)的細胞器靶向定位甚至進入到細胞核中仍然是個極具挑戰(zhàn)性的任務[10]．

PEG是一種呈中性的水溶性聚合物分子，具有良好的生物相容性，被廣泛地用作修飾或摻雜分子以提高生物材料的生物相容性[11-12]．修飾PEG的方法大致可分為2類：一步合成和二步修飾．一步合成方法主要將PEG作為碳量子點合成的碳源或鈍化劑，使得碳量子點在合成后含有PEG，擁有良好的生物相容性[13]；二步修飾方法是在合成碳量子點后，再將PEG作為可修飾的功能分子，通過共價鍵偶聯(lián)至碳量子點表面，PEG能很好地保持其分子的完整性，對碳量子點的物理、化學和熒光等方面的穩(wěn)定性有著很大的提升，提高了碳量子點的抗環(huán)境干擾能力[14]．TAT被用作經(jīng)典的核定位信號序列，可用于實現(xiàn)碳量子點作為納米載體對細胞核靶向的功能[15]．FA是一種典型的細胞靶向分子，能與細胞膜上的葉酸受體相結合，促進其進入細胞，而癌細胞表面擁有過度表達的葉酸受體，可以通過FA實現(xiàn)被癌細胞攝取的能力[16]．

本文用預先羧基化處理的碳量子點(CD)修飾生物分子PEG，TAT和FA，制備了生物功能化的碳量子點．第1步利用羧基與氨基的EDC/NHS反應一步在羧基化的碳量子點表面偶聯(lián)上PEG和TAT，制備了具有良好生物相容性和細胞核靶向的水溶性碳量子點(TAT-CD-PEG)．第2步通過TAT-CD-PEG上PEG部分的羥基與FA的羧基之間的酯化反應，將FA修飾至TAT-CD-PEG的表面，為碳量子點提供癌細胞受體介導內(nèi)吞的功能，最終制備得到PEG，TAT和FA修飾的具有生物功能的碳量子點．

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

主要試劑包括：合成碳量子點的原材料檸檬酸(CA)和乙二胺(EDA)，氫氧化鈉(NaOH)，氯乙酸鈉(ClCH2COONa)，聚乙二醇(PEG)，葉酸(FA)，核定位肽(TAT)，EDC，NHS，PB緩沖液(pH=8.0)．實驗所有試劑均為分析純，所用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm．

主要儀器包括：F-7000型熒光分光光度計(日本Hitachi公司)；JEM-2100型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)； ZS90型電位粒度分析儀(美國Malvern公司)；紅外光譜儀(美國Thermo 公司)；TSC-SP8型共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；冷凍干燥機(中國北京醫(yī)康實驗儀器有限公司)；CT18RT型離心機(美國Techcomp公司)；KQ-500DB型超聲波振蕩儀(中國昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(日本Hitachi公司)．

1.2 碳量子點的制備

碳量子點合成根據(jù)文獻報道的方法[17]，以檸檬酸為碳源，乙二胺為表面鈍化劑，通過水熱法合成，具體方法為：合成所用檸檬酸與乙二胺以摩爾比為1∶4溶于50 mL水中，再將溶液轉移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應釜中，在180 ℃條件下加熱5 h；待冷卻至室溫后，將得到的碳量子點原液用分子截留量為1 kDa的透析袋透析2 d，除去未反應完全的反應物；最后將透析后的碳量子點溶液用冷凍干燥機進行濃縮，得到純化后的碳量子點溶液．

1.3 碳量子點羧基化

將1 mg/mL的碳量子點溶液與含有125 mg NaOH和125 mg ClCH2COONa的水溶液混合，水浴超聲3 h；再將此碳量子點溶液用稀HCl調節(jié)pH值至中性后，用分子截留量為1 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到羧基化的碳量子點溶液．

1.4 熒光量子產(chǎn)率計算

碳量子點的熒光量子產(chǎn)率通過以下公式計算得到：

式中，Q,QR分別為待計算物質和參照熒光物質的熒光量子產(chǎn)率；I,IR分別為待計算物質和參照熒光物質的發(fā)射光譜熒光強度；A,AR分別為待計算物質和參照熒光物質的吸收強度;n,nR分別為待計算物質和參照熒光物質的折射率．本文選取的參照熒光物質為硫酸奎寧，當以360 nm為激發(fā)波長時，硫酸奎寧在0.1 mol/L的硫酸溶液中的熒光量子產(chǎn)率為0.54．碳量子點與硫酸奎寧的溶劑折射率均為1.33，為最小化吸收帶來的影響，取碳量子點吸收值強度小于0.1，以此計算得碳量子點的熒光量子產(chǎn)率．

1.5 TAT-CD-PEG制備

將1 mg/mL羧基化后的碳量子點溶液與含有15 mg EDC和10 mg NHS的水溶液混合，水浴超聲1 h，對碳量子點表面的羧基進行活化；往活化后的碳量子點溶液中同時加入20 mg/mL的PEG溶液和4 mg/mL的TAT溶液，攪拌24 h，用分子截留量為2 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到PEG和TAT修飾的碳量子點(TAT-CD-PEG)．

1.6 FA偶聯(lián)TAT-CD-PEG

通過FA一端的羧基與TAT-CD-PEG表面的羥基之間的酯化反應，將FA修飾至TAT-CD-PEG表面．具體實驗過程如下:將FA溶于pH為8.0的PB緩沖液中，得到濃度為1 mg/mL的FA溶液，與含有10 mg EDC和15 mg NHS的PB緩沖液混合，活化FA上的羧基1 h；隨后往活化后的FA溶液中加入4 mg/mL的TAT-CD-PEG溶液，室溫避光環(huán)境下攪拌24 h，用分子截留量為1 kDa的透析袋透析1 d，經(jīng)冷凍干燥濃縮后得到TAT-CD-PEG-FA．

1.7 細胞成像

HeLa細胞擁有較大的細胞核，將其選作成像用細胞．分別完成了TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA與HeLa細胞培養(yǎng)2組實驗．在HeLa細胞培養(yǎng)液中分別加入0.1 mg/mL的TAT-CD-PEG和TAT-CD-PEG-FA溶液與HeLa細胞共培養(yǎng)，分別培養(yǎng)2, 4, 6, 12 h后，用PB緩沖液沖洗，并用多聚甲醛將細胞固定，用核酸染料Syto 9對HeLa細胞核進行染色，通過共聚焦顯微鏡觀察成像結果．用405 nm激發(fā)波長激發(fā)TAT-CD-PEG-FA熒光，收集440～460 nm范圍內(nèi)發(fā)射的熒光，488 nm激發(fā)波長激發(fā)Syto 9，收集490～510 nm范圍內(nèi)發(fā)射的熒光．

2 實驗結果與討論

2.1 CD的性質

圖1對CD的性質進行了表征．由CD的熒光光譜(見圖1(a))可看出，該CD沒有激發(fā)波長依賴性，在以320～380 nm波長激發(fā)時，CD的發(fā)射波長在450 nm處，屬于藍光波長范圍，在紫外燈照射下CD呈明亮的藍色熒光(見圖1(b))．該CD具有良好的熒光性質．對CD的吸收(見圖1(c))進行了測定，CD在350 nm處有非常明顯的吸收峰，并且通過CD在360 nm處的吸收值，由熒光量子產(chǎn)率公式計算出CD的熒光量子產(chǎn)率為 25%．進一步對CD進行了TEM表征(見圖1(d))，從TEM照片可以看出CD具有很好的單分散性，經(jīng)粒徑統(tǒng)計(見圖1(e))，CD的尺寸為(1.4±0.5) nm．通過熒光特性和粒徑分析可以得知CD具有良好的光學性質，并且具有較小且均一的尺寸分布和良好的單分散性，可用于進一步的生物功能化．

(a) 熒光光譜

(b) 熒光照片

(c) 吸收光譜

(d) TEM

(e) 粒徑統(tǒng)計

圖1 CD性質表征

2.2 TAT-CD-PEG-FA的熒光和紅外表征

圖2 TAT-CD-PEG-FA制備示意圖

(a) 熒光光譜

(b) 紅外光譜

2.3 TAT-CD-PEG-FA的物理化學性質

制備完成TAT-CD-PEG-FA后，使用電位粒度分析儀對其Zeta電位與DLS進行了測量．從Zeta電位圖譜(見圖4(a))中可看出，CD生物功能化前后的Zeta電位發(fā)生了變化，由最初CD的-24.3 mV到TAT-CD-PEG的-3.2 mV，再到TAT-CD-PEG-FA的2.4 mV，表明CD在進行兩步生物功能化之后Zeta電位呈中性．水動力尺寸(見圖4(b))從最初的4.1 nm 到最后的6.1 nm，表明在生物功能化后CD的水合動力尺寸有略微增加，仍保持了較小的水合動力尺寸．為了確保TAT-CD-PEG-FA能應用于細胞內(nèi)，對其進行細胞毒性實驗，MTT實驗(見圖4(c))表明在不同濃度TAT-CD-PEG-FA條件下，細胞存活率在95 %以上，表明該TAT-CD-PEG-FA具有低毒性．納米材料在細胞內(nèi)進行應用需要滿足以下特點：① 低毒性，保證材料在進入細胞后，不會對細胞生存和正常的代謝活動產(chǎn)生較大的影響或殺死細胞；② 生物相容性好，良好的生物相容性能使納米材料更容易進入細胞；③ 小尺寸，尺寸越大進入細胞的難度越大，甚至有可能引起細胞的免疫應答，小尺寸的納米材料更容易被細胞吞噬進細胞內(nèi)；④ 呈電中性，細胞內(nèi)有各種帶電的蛋白，呈正電或負電的納米材料進入細胞容易通過經(jīng)典作用被細胞的蛋白吸附，造成非特異性吸附，不利于納米材料在細胞內(nèi)實現(xiàn)相應的功能．本文中合成的CD本身具有小尺寸和低毒性的特點，經(jīng)過PEG和FA生物功能化修飾后不僅能提高CD的生物相容性，還能提高CD進入細胞的效率．經(jīng)生物功能化后，TAT-CD-PEG-FA仍然具有較小的水合動力尺寸，并且?guī)щ娦猿手行?，可將此TAT-CD-PEG-FA應用于細胞內(nèi)．

2.4 細胞成像

將未修飾FA的碳點TAT-CD-PEG和生物功能化碳量子點TAT-CD-PEG-FA分別與HeLa細胞共培養(yǎng)，經(jīng)2組實驗對比驗證TAT-CD-PEG-FA 上的FA能通過癌細胞表面的FA受體實現(xiàn)對TAT-CD-PEG-FA的快速內(nèi)吞和TAT-CD-PEG-FA的細胞核靶向作用．通過共聚焦顯微鏡觀察所制備的TAT-CD-PEG-FA在2組細胞實驗中癌細胞受體介導內(nèi)吞的功能與細胞核靶向的能力．在共聚焦顯微鏡成像結果(見圖5)中，藍色熒光為碳量子點熒光，綠色熒光為細胞核染料Syto 9的熒光．可以看出，TAT-CD-PEG與HeLa細胞培養(yǎng)4 h后細胞質中出現(xiàn)明顯的CD藍色熒光；12 h后細胞核中CD的藍色熒光明顯增強．而TAT-CD-PEG-FA與HeLa細胞培養(yǎng)2 h后細胞質中已出現(xiàn)明顯的碳量子點藍色熒光，6 h后細胞核中出現(xiàn)明顯CD藍色熒光，12 h后細胞質與細胞核中碳量子點藍色熒光相對6 h時無明顯變化．實驗結果表明，CD修飾FA使癌細胞更易于攝取CD，提高了CD進入細胞的速度，而TAT的修飾使CD具有細胞核靶向的功能．

(a) Zeta電位

(b) DLS

(c) MTT實驗

圖4 物理化學性質表征

(a) TAT-CD-PEG與細胞培養(yǎng)2 h

(b) TAT-CD-PEG與細胞培養(yǎng)4 h

(c) TAT-CD-PEG與細胞培養(yǎng)6 h

(d) TAT-CD-PEG與細胞培養(yǎng)12 h

(e) TAT-CD-PEG-FA與細胞 培養(yǎng)2 h

(f) TAT-CD-PEG-FA與細胞 培養(yǎng)4 h

(g) TAT-CD-PEG-FA與細胞 培養(yǎng)6 h

(h) TAT-CD-PEG-FA與細胞 培養(yǎng)12 h

圖5 細胞成像熒光共聚焦圖片

3 結論

1) 碳量子點具有良好的熒光性質且具有低毒性、生物相容性好和易于表面修飾的特點，使得碳量子點在細胞內(nèi)離子、生物分子的檢測與細胞熒光成像方面的應用有著明顯的優(yōu)勢．對碳量子點進行功能化，不僅能提升碳量子點的性質，還能賦予碳量子點特殊功能，擴展碳量子點在各個領域中的應用．

2) 本文合成了熒光性質優(yōu)異的碳量子點，為了使碳量子點在細胞熒光成像分析中的應用更為廣泛，對預先羧基化處理的碳量子點通過共價修飾的方式進行了生物功能化．PEG，TAT和FA的修飾分別賦予了碳點良好的生物相容性、細胞核靶向和易于被癌細胞攝取的能力，成功制備了生物功能化碳量子點(TAT-CD-PEG-FA)．該生物功能化的碳量子點具有電中性、小尺寸、低毒性的特點和細胞核靶向的能力，并且能夠實現(xiàn)細胞內(nèi)的熒光成像分析．

3) 良好的物理化學性質保證了生物功能化碳點有望被用作納米示蹤劑，可實現(xiàn)細胞內(nèi)的癌癥標志物或特殊藥物靶點的高分辨原位熒光成像分析．該生物功能化碳量子點可作為納米載體，實現(xiàn)對抗癌藥物指定位置的運輸，達到“精準醫(yī)療”的目的．

DOI:10.1039/c6ra11660d.

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