張占強(qiáng)，吳春艷，方 彬，王美玲，?；燮G

(1. 河北省涿州市醫(yī)院，河北 涿州 072750；2. 河北省保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)疾病，近年來(lái)其發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。COPD的病理基礎(chǔ)是氣道壁和肺實(shí)質(zhì)的慢性炎癥及結(jié)構(gòu)破壞，可表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)改變及外周血T淋巴細(xì)胞數(shù)量異常[2]。研究表明，輔助性T細(xì)胞17(Th17)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)參與各種自身免疫性疾病和慢性感染性疾病中的免疫調(diào)節(jié)，在COPD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[3-4]。而白細(xì)胞介素-17(IL-17)是Th17細(xì)胞特異性分泌的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)機(jī)體組織損傷，并參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究通過(guò)觀察慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細(xì)胞中Th17和Treg細(xì)胞含量及IL-17水平變化，并分析Th17、Treg及IL-17與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性，探討Th17、Treg及IL-17在COPD患者預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值，以期為臨床防治提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 選取2014年1月—2016年10月河北省涿州市醫(yī)院呼吸內(nèi)科收治的COPD患者共184例作為COPD組，其中男118例，女66例，年齡36～81(63.28±10.16)歲。COPD穩(wěn)定期患者92例，COPD急性加重期(AECOPD)患者92例。COPD的診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)慢性阻塞性肺疾病學(xué)組修訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013年修訂版)》[6]。排除合并有其他肺部疾病或感染者，合并有其他系統(tǒng)疾病如心、肝、腦、腎等嚴(yán)重功能障礙者，長(zhǎng)期應(yīng)用激素者，惡性腫瘤或預(yù)計(jì)生存期不到3個(gè)月者，近期手術(shù)、妊娠及哺乳期者。另選取同期我院健康體檢者95例作為對(duì)照組，男60例，女35例，年齡38～79(62.54±9.83)歲。各組性別、年齡及病史等基本資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，均具有可比性。

1.2主要儀器及試劑 美國(guó)Becton Dickinson公司的FACS Calibur流式細(xì)胞儀，流式抗體均購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。細(xì)胞刺激培養(yǎng)所需離子霉素、豆蔻酰佛波醇乙酯、莫能菌素購(gòu)自美國(guó)ENZO Alexis-Biomol公司，胞內(nèi)檢測(cè)所需固定破膜試劑盒及熒光定量PCR所需試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，所需引物、探針由上海博亞生物技術(shù)公司合成。熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司(ABI 7500 Sequence Detection System)，酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司(型號(hào)550)，低溫高速離心機(jī)(Beckman)。ELISA試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3研究方法 比較各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17水平及肺功能指標(biāo)情況，分析Th17、Treg、Th17/Treg、IL-17與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性，并應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對(duì)AECOPD患者的診斷效能。

1.3.1外周血Th17及Treg細(xì)胞檢測(cè) 所有研究對(duì)象均于清晨空腹采集靜脈血3 mL，經(jīng)肝素抗凝及加入等體積淋巴細(xì)胞分離液后1 500 r/min離心15 min，得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)懸液，鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，并在RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清。每孔加入豆蔻酰佛波醇乙酯2.5 μL(終濃度50 ng/mL)、離子霉素2 μL(終濃度1 μg/mL)及莫能菌素2 μL(終濃度10 μg/mL)吹打混勻，孵育4 h。加入抗人CD4單抗20 μL，室溫避光孵育20 min。再通過(guò)加入染色緩沖液2 mL及抗IL-17單抗20 μL，室溫孵育15 min，此后1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入染色固定液1 mL，等待上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.2肺功能檢查 采用肺功能儀(Sensormedics)對(duì)所有研究對(duì)象行肺功能檢查，包括測(cè)定第1秒用力呼氣量(FEV1)、FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)、用力肺活量(FVC)、FVC占預(yù)計(jì)值百分比(FVC%)及第1秒用力呼氣量占用力肺活量的百分比(FEV1/FVC)。目前臨床上以FEV1作為COPD診斷、分級(jí)和衡量預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1COPD組與對(duì)照組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05),外周血Treg細(xì)胞含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

2.2各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較 AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于COPD穩(wěn)定期組(P均<0.05)。AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組外周血Treg細(xì)胞含量均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)，且AECOPD組外周血Treg細(xì)胞含量明顯低于COPD穩(wěn)定期組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3各組肺功能指標(biāo)比較 AECOPD組和COPD穩(wěn)定期組FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于對(duì)照組(P均<0.05)；且AECOPD組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC均明顯低于COPD穩(wěn)定期組(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17水平比較

表3 各組肺功能指標(biāo)比較

2.4外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.05)；而COPD患者外周血Treg細(xì)胞與FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC均呈正相關(guān)(P均<0.05)。其中外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關(guān)性較好(r=-0.747，-0.753，P<0.05)。見(jiàn)表4和圖1。

2.5外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對(duì)AECOPD的診斷價(jià)值 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的AUC及95%CI分別為0.862[0.764，0.963]，0.783[0.705，0.848]，0.814[0.726，0.875]，0.851[0.758，0.946]與對(duì)照組(AUC=0.5)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。取外周血Th17最佳臨界值為7.28%時(shí)，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。見(jiàn)圖2和表5。

表4 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

表5 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對(duì)AECOPD的診斷價(jià)值

圖1 外周血Th17、IL-17與FEV1%的相關(guān)性

圖2 外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17診斷AECOPD的ROC曲線

3 討 論

COPD是各種炎癥細(xì)胞參與的全身異常炎癥反應(yīng)性疾病，以不完全可逆的氣流受限為主要特征。目前，COPD的發(fā)病率較高，預(yù)后較差，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康，同時(shí)給患者及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，如何早期診斷及預(yù)測(cè)其病情嚴(yán)重程度對(duì)降低COPD的病死率具有重要意義。

Th17與Treg是一類(lèi)近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的淋巴細(xì)胞亞群，兩者分化上相互關(guān)聯(lián)，功能上相互拮抗，Th17/Treg細(xì)胞的平衡關(guān)系對(duì)于維持機(jī)體免疫穩(wěn)定和預(yù)防炎癥性疾病的發(fā)生具有重要作用[7-8]。Th17細(xì)胞分泌的IL-17可促使體內(nèi)炎癥細(xì)胞釋放大量的致炎因子和趨化因子，誘導(dǎo)和活化中性粒細(xì)胞，進(jìn)而引起中性粒細(xì)胞向炎癥組織聚集[9]。多項(xiàng)研究表明，Th17/Treg可能在慢性炎癥性肺部疾病發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[10-11]。本研究結(jié)果顯示，COPD組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯高于對(duì)照組，而COPD組外周血Treg細(xì)胞含量明顯低于對(duì)照組，與Li等[12]研究結(jié)果基本一致。這提示Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17可能參與COPD的發(fā)生發(fā)展。Chang等[13]研究表明，在COPD患者中CD8+和CD4+細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子IL-17A和IL-17F相對(duì)于對(duì)照組是明顯增加的。COPD是慢性炎癥反應(yīng)，且炎癥主要從肺部產(chǎn)出，引起全身炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起組織破壞的病理性免疫應(yīng)答發(fā)生，使Treg細(xì)胞含量減少。與對(duì)照組比較，COPD穩(wěn)定期組外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平明顯升高，且AECOPD組升高更明顯；與對(duì)照組比較，COPD穩(wěn)定期組外周血Treg細(xì)胞含量明顯下降，且AECOPD組下降更明顯。可見(jiàn)Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17在COPD的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用，與COPD癥狀嚴(yán)重程度密切相關(guān)。Domagaa-Kulawik等[14]研究認(rèn)為，Th17/Treg平衡參與了COPD的免疫調(diào)節(jié)過(guò)程，使得Th17及Treg細(xì)胞含量在COPD患者不同時(shí)期中存在差異。另有研究也表明，IL-17作為致炎因子，全程參與了COPD患者炎癥的發(fā)生、發(fā)展，隨著COPD病變程度的加重，IL-17水平隨之升高，Th17細(xì)胞及其特異性分泌因子IL-17可能介導(dǎo)了COPD的炎癥過(guò)程[15-16]。與對(duì)照組比較，COPD穩(wěn)定期組FEV1、FEV1%、FVC%、FEV1/FVC明顯下降，且AECOPD組下降更明顯。相關(guān)性分析顯示，COPD患者外周血Th17、Th17/Treg及IL-17水平隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯升高；COPD患者外周血Treg細(xì)胞含量隨FEV1、FEV1%、FVC、FVC%、FEV1/FVC的下降而明顯下降。這說(shuō)明自身免疫功能失調(diào)對(duì)COPD患者肺功能的下降產(chǎn)生重要的影響，Th17型免疫應(yīng)答介導(dǎo)了COPD發(fā)病過(guò)程中的自身免疫應(yīng)答，同時(shí)由于COPD患者體內(nèi)具有免疫抑制作用的Treg細(xì)胞數(shù)下降或功能異?？梢鸹颊叻喂δ苤笜?biāo)下降。既往研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫反應(yīng)是導(dǎo)致COPD患者持續(xù)存在氣道慢性炎癥的主要原因，而持續(xù)存在氣道慢性炎癥可導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷甚至氣道重塑，最終導(dǎo)致肺功能損傷[17-18]。此外，IL-17參與了COPD患者肺部慢性炎癥進(jìn)展的病理?yè)p傷，IL-17水平與COPD氣道受限加重程度呈正相關(guān)[19]。應(yīng)用ROC曲線分析顯示，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17對(duì)AECOPD的診斷具有重要的參考價(jià)值，而且外周血Th17最佳臨界值為7.28%時(shí)，其診斷AECOPD的靈敏度和特異度最好，分別為80.4%和87.3%。說(shuō)明外周血Th17細(xì)胞水平可有效地反映COPD患者病情嚴(yán)重程度，是預(yù)測(cè)COPD急性加重的可靠指標(biāo)。Podolin等[20]研究也表明，外周血Th17細(xì)胞水平較傳統(tǒng)感染標(biāo)志物(CRP、WBC)更能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)感染和炎癥水平，是早期預(yù)測(cè)AECOPD的有效指標(biāo)。因此，通過(guò)抑制COPD患者外周血Th17細(xì)胞水平，可顯著降低患者機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而改善患者預(yù)后。

綜上所述，外周血Th17、Treg、Th17/Treg及IL-17參與了COPD患者呼吸道慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并可能導(dǎo)致炎癥的持續(xù)存在及肺功能的逐步損害，同時(shí)與COPD病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。但本研究為小樣本單中心研究，可能存在一定的偏倚，尚需多中心、大規(guī)模的前瞻性研究來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。