高效毛細管電泳法測定泳池中尿液指示物乙?；前匪徕?/h1>
2018-08-02 09:17:30韓燕禎朱懷嬌石紅梅徐向東
分析測試學(xué)報 2018年7期
韓燕禎，朱懷嬌，石紅梅,徐向東*
(1.河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017；2.河北省環(huán)境與人群健康重點實驗室,河北 石家莊 050017)
泳池與公共浴池中人體尿液量是公共衛(wèi)生關(guān)注的一個問題，尿液含量的高低反映了泳池的衛(wèi)生狀況。尿液不僅可傳染某些疾病[1-2]，引發(fā)眼部紅腫不適[3]，而且尿液中含有的尿素、氨、氨基酸和肌酐等多種含氮化合物，可與泳池消毒劑反應(yīng)生成多種消毒副產(chǎn)物，這些產(chǎn)物達一定濃度時可對人體產(chǎn)生毒性或引起過敏、哮喘[4]，因此泳池水中尿液含量的監(jiān)測對于公共衛(wèi)生具有重要意義。
目前，我國通過檢測泳池或公共浴池中尿素的含量來判斷池水是否受到尿液污染。雖然此法符合公眾在直觀上的認識，但也存在嚴重缺陷：一是人體不僅通過排尿方式排出尿素，而且也以出汗的方式通過皮膚排泄尿素。有研究證實水中運動時，29 ℃以下水溫中人皮膚出汗率為0.1～0.2 L·(m2·h)-1，水溫35 ℃時出汗率升至0.8 L·(m2·h)-1，說明不能忽略經(jīng)排汗產(chǎn)生的尿素。其次，由于加入池中的消毒劑多為液氯、次氯酸鈣、次氯酸鈉、三氯異氰尿酸鈉等含氯化學(xué)品，會與尿素產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，生成三氯胺等[6-7]，影響對尿素的檢測。因此，非常有必要尋找一種穩(wěn)定、不與消毒劑反應(yīng)且只通過尿液排泄的標志物，用于泳池或公共浴池中尿液污染的檢測。
乙?；前匪徕?Acesulfame-K,ACE)是一種廣泛使用的人工合成甜味劑，又名安賽蜜，廣泛應(yīng)用于各種食品中[8]，其進入人體后完全以原形經(jīng)尿液排出且形態(tài)穩(wěn)定[9-10]。因為ACE只來源于人體尿液，具有代表性和特異性[11-13]，近年來，加拿大、英國、美國等國的研究人員以水樣中ACE的檢測濃度來推算尿液的含量。人體排出的尿液經(jīng)泳池水的極大稀釋后其中的ACE濃度很低。此外，人體皮脂、汗水、尿液排放等對池水造成的污染，以及化學(xué)消毒劑與其消毒副產(chǎn)物，為復(fù)雜的泳池水中極微量ACE的檢測帶來了挑戰(zhàn)。
目前，游泳池水中ACE的檢測方法有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]和離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]。但質(zhì)譜儀價格昂貴，樣品處理復(fù)雜，應(yīng)用受到限制。高效毛細管電泳法是20世紀80年代以來發(fā)展最快的分析方法之一，其以高壓電場為驅(qū)動力，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異實現(xiàn)分離分析，具有分離效率高、運行成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點[17]。尚未見采用毛細管電泳檢測泳池水中ACE含量的文獻報道。本研究建立了一種泳池水中ACE的檢測方法，采用固相萃取法簡單處理樣品，通過毛細管電泳分離檢測，為泳池水中ACE的檢測提供了靈敏、簡便、經(jīng)濟實用的方法。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
P/ACETMMDQ高效毛細管電泳儀(配DAD檢測器和32Karat數(shù)據(jù)處理軟件，上海愛博才思分析儀器有限公司)；無涂層熔融石英毛細管(60.2 cm×75 μm，有效長度50 cm，河北永年縣銳灃色譜器件有限公司)；隔水式培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Labnet 旋渦混勻器VX-200(上海京工實業(yè)有限公司)；Oasis?HLB 固相萃取小柱(500 mg/6 mL,美國Waters公司)。
ACE標準品(北京索萊寶科技公司)，用超純水配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，4 ℃冰箱保存待用；硼砂、硼酸、氨水、氫氧化鈉(分析純)，鹽酸(優(yōu)級純)，均購于北京化學(xué)試劑廠；甲醇(色譜純，Honeywell Burdick & Jackson公司)；實驗用水為超純水。
1.2 實驗方法
以10 mmol/L硼砂溶液(0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 9.3)為電泳緩沖液，紫外檢測波長為226 nm，采用壓力進樣，進樣時間20 s,在24 kV恒定電壓，25 ℃柱溫下進行電泳。每次實驗前依次用1 mol/L的NaOH沖洗20 min，水沖洗5 min，運行緩沖液沖洗10 min。每兩次進樣間用1 mol/L NaOH、水和運行緩沖液各沖洗1 min。
1.3 樣品處理
將30 mL游泳池水樣用0.22 μm濾膜過濾后，過Oasis?HLB 固相萃取小柱(預(yù)先用6 mL甲醇和6 mL水活化)，用3 mL 1.0× 10-4mol/L(pH 4.0)的鹽酸淋洗，真空抽干，用5 mL 含5%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，于60 ℃氮氣吹干后，用250 μL水復(fù)溶。混勻后直接進樣檢測。
2 結(jié)果與討論
2.1 測定波長的選擇
將ACE標準溶液在190～300 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，觀察到ACE在226 nm處有最大吸收，因此選擇最佳檢測波長為226 nm。
2.2 緩沖溶液濃度的選擇
考察了磷酸鹽和硼酸鹽兩種緩沖體系，發(fā)現(xiàn)硼酸鹽體系的出峰信號及峰形更好，因此選用硼酸鹽體系對ACE進行分離檢測。文獻中毛細管電泳分離緩沖溶液的濃度一般至少為10 mmol/L才具備良好的緩沖容量，保證進樣瞬間分離緩沖溶液的pH值和電導(dǎo)不改變[15-16]，因此本實驗考察了硼砂濃度在10～50 mmol/L范圍內(nèi)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著硼砂濃度的增大，ACE的出峰時間延后，峰電流增大，峰高減小。綜合考慮選擇硼砂濃度為10 mmol/L。
圖1 緩沖溶液pH值對峰信號值的影響Fig.1 Influence of pH value on ACE signal
2.3 緩沖溶液pH值的選擇
以電滲流(EOF)為驅(qū)動力的毛細管電泳法，其EOF對緩沖溶液的pH值十分敏感。緩沖溶液的pH 值影響毛細管表面的Zeta電勢，進而影響EOF的方向和大??；pH值也影響樣品中各組分分子表面電荷數(shù)量，進而影響組分遷移速率及分離效果。因此，pH值對分離效果影響較大[18]。本實驗考察了硼砂緩沖溶液pH值在8.3～10.0范圍時對ACE出峰信號、時間、峰高及峰形的影響(圖1)。由圖1可知，緩沖溶液的pH值為9.3時，峰高值最大，且電泳圖譜中峰形較佳。因此選擇pH值為9.3。
2.4 分離電壓的選擇
分離電壓是分離的動力，決定電場強度，進而影響 EOF 大小及帶電粒子遷移速率，從而決定組分遷移時間。通常電壓升高，電泳和電滲速度增加，樣品分析時間縮短。本實驗考察了不同分離電壓(18～29 kV)對ACE遷移時間的影響，結(jié)果表明分離電壓越高，遷移時間越短。當分離電壓為24 kV時，遷移時間較短，峰高值較大，峰形較好，因此實驗選擇24 kV作為分離電壓。
2.5 進樣時間的選擇
本方法采用壓力進樣法，考察了不同進樣時間(5、10、15、20、25、30 s)對測定的影響。結(jié)果表明：延長進樣時間會增加進樣量，導(dǎo)致峰高值增大，但過長的進樣時間會導(dǎo)致峰展寬，峰形變差，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。實驗最終選擇進樣時間為20 s，此時可以獲得合適的峰形。
2.6 線性范圍、檢出限與精密度
吸取適量標準儲備液，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、2.5、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的系列溶液,在最佳電泳條件下測定，以峰高(y)對相應(yīng)質(zhì)量濃度(x，mg/L)進行線性回歸。結(jié)果表明，ACE在0.2～100.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.114x+0.04，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8，檢出限(LOD，S/N=3)為50.0 μg/L。對10 mg/L ACE標準溶液連續(xù)進樣7次，計算得到遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別為0.73%和1.8%。
圖2 泳池水樣與加標后毛細管電泳圖Fig.2 Capillary electrophoresis chromatograms of sample and standard addition
2.7 樣品分析及加標回收率
在優(yōu)化實驗條件下，樣品及樣品加標后的電泳譜圖見圖2。由圖可見，經(jīng)過固相萃取富集純化后，ACE與樣品基質(zhì)中的其他物質(zhì)實現(xiàn)了良好分離。為驗證方法的可靠性，取其中1個樣品平行測定3份，分別加入不同質(zhì)量濃度(2.5、26.0、72.0 mg/L)的標準品進行加標回收率實驗，每個質(zhì)量濃度平行測定3次，得加標回收率分別為103.6%、100.5%和96.0%。
收集石家莊市不同泳池的21個水樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，按“1.3”所述用Oasis?HLB固相萃取小柱濃縮富集120倍，在226 nm波長下采用毛細管電泳法在優(yōu)化實驗條件下進行分離檢測，結(jié)果如表1所示。其中15份水樣檢出ACE，質(zhì)量濃度為1.64～39.25 μg/L，所測泳池水中ACE含量高于文獻報道中加拿大泳池水的ACE檢測數(shù)據(jù)(0.03～7.11 μg/L)[13]。2016年的一項調(diào)查研究顯示中國人尿液中ACE的平均含量為4 070 μg/L[18]。由于城市自來水中ACE的含量處于很低的水平(6～15 ng/L)[13]，因此可用人尿液中乙酰磺胺酸鉀的平均含量來估計游泳池中的尿液量。
表1 實際樣品測定結(jié)果Table 1 Analytical results of real samples
*no detected
3 結(jié) 論
乙?；前匪徕浽谧詠硭腿四蛞褐袕V泛存在，可用作泳池和浴池中尿液排放的指示物。本文采用高效毛細管電泳法結(jié)合固相萃取技術(shù)，建立了游泳池水中ACE的測定新方法。該方法的加標回收率為96.0%～103.6%，遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別為0.73%和1.8%，檢出限為50.0 μg/L。方法靈敏、準確、可靠，適用于游泳池水中ACE的檢測分析。通過ACE濃度可以估測泳池水中尿液的含量，從而為泳池水中尿液量監(jiān)測提供了更為科學(xué)和準確的途徑。
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乙?；前匪徕?Acesulfame-K,ACE)是一種廣泛使用的人工合成甜味劑，又名安賽蜜，廣泛應(yīng)用于各種食品中[8]，其進入人體后完全以原形經(jīng)尿液排出且形態(tài)穩(wěn)定[9-10]。因為ACE只來源于人體尿液，具有代表性和特異性[11-13]，近年來，加拿大、英國、美國等國的研究人員以水樣中ACE的檢測濃度來推算尿液的含量。人體排出的尿液經(jīng)泳池水的極大稀釋后其中的ACE濃度很低。此外，人體皮脂、汗水、尿液排放等對池水造成的污染，以及化學(xué)消毒劑與其消毒副產(chǎn)物，為復(fù)雜的泳池水中極微量ACE的檢測帶來了挑戰(zhàn)。
目前，游泳池水中ACE的檢測方法有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13-14]和離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]。但質(zhì)譜儀價格昂貴，樣品處理復(fù)雜，應(yīng)用受到限制。高效毛細管電泳法是20世紀80年代以來發(fā)展最快的分析方法之一，其以高壓電場為驅(qū)動力，毛細管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為的差異實現(xiàn)分離分析，具有分離效率高、運行成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點[17]。尚未見采用毛細管電泳檢測泳池水中ACE含量的文獻報道。本研究建立了一種泳池水中ACE的檢測方法，采用固相萃取法簡單處理樣品，通過毛細管電泳分離檢測，為泳池水中ACE的檢測提供了靈敏、簡便、經(jīng)濟實用的方法。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
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1.2 實驗方法
以10 mmol/L硼砂溶液(0.1 mol/L NaOH調(diào)至pH 9.3)為電泳緩沖液，紫外檢測波長為226 nm，采用壓力進樣，進樣時間20 s,在24 kV恒定電壓，25 ℃柱溫下進行電泳。每次實驗前依次用1 mol/L的NaOH沖洗20 min，水沖洗5 min，運行緩沖液沖洗10 min。每兩次進樣間用1 mol/L NaOH、水和運行緩沖液各沖洗1 min。
1.3 樣品處理
將30 mL游泳池水樣用0.22 μm濾膜過濾后，過Oasis?HLB 固相萃取小柱(預(yù)先用6 mL甲醇和6 mL水活化)，用3 mL 1.0× 10-4mol/L(pH 4.0)的鹽酸淋洗，真空抽干，用5 mL 含5%氨水的甲醇洗脫，收集洗脫液，于60 ℃氮氣吹干后，用250 μL水復(fù)溶。混勻后直接進樣檢測。
2 結(jié)果與討論
2.1 測定波長的選擇
將ACE標準溶液在190～300 nm范圍內(nèi)進行波長掃描，觀察到ACE在226 nm處有最大吸收，因此選擇最佳檢測波長為226 nm。
2.2 緩沖溶液濃度的選擇
考察了磷酸鹽和硼酸鹽兩種緩沖體系，發(fā)現(xiàn)硼酸鹽體系的出峰信號及峰形更好，因此選用硼酸鹽體系對ACE進行分離檢測。文獻中毛細管電泳分離緩沖溶液的濃度一般至少為10 mmol/L才具備良好的緩沖容量，保證進樣瞬間分離緩沖溶液的pH值和電導(dǎo)不改變[15-16]，因此本實驗考察了硼砂濃度在10～50 mmol/L范圍內(nèi)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著硼砂濃度的增大，ACE的出峰時間延后，峰電流增大，峰高減小。綜合考慮選擇硼砂濃度為10 mmol/L。
圖1 緩沖溶液pH值對峰信號值的影響Fig.1 Influence of pH value on ACE signal
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以電滲流(EOF)為驅(qū)動力的毛細管電泳法，其EOF對緩沖溶液的pH值十分敏感。緩沖溶液的pH 值影響毛細管表面的Zeta電勢，進而影響EOF的方向和大??；pH值也影響樣品中各組分分子表面電荷數(shù)量，進而影響組分遷移速率及分離效果。因此，pH值對分離效果影響較大[18]。本實驗考察了硼砂緩沖溶液pH值在8.3～10.0范圍時對ACE出峰信號、時間、峰高及峰形的影響(圖1)。由圖1可知，緩沖溶液的pH值為9.3時，峰高值最大，且電泳圖譜中峰形較佳。因此選擇pH值為9.3。
2.4 分離電壓的選擇
分離電壓是分離的動力，決定電場強度，進而影響 EOF 大小及帶電粒子遷移速率，從而決定組分遷移時間。通常電壓升高，電泳和電滲速度增加，樣品分析時間縮短。本實驗考察了不同分離電壓(18～29 kV)對ACE遷移時間的影響，結(jié)果表明分離電壓越高，遷移時間越短。當分離電壓為24 kV時，遷移時間較短，峰高值較大，峰形較好，因此實驗選擇24 kV作為分離電壓。
2.5 進樣時間的選擇
本方法采用壓力進樣法，考察了不同進樣時間(5、10、15、20、25、30 s)對測定的影響。結(jié)果表明：延長進樣時間會增加進樣量，導(dǎo)致峰高值增大，但過長的進樣時間會導(dǎo)致峰展寬，峰形變差，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。實驗最終選擇進樣時間為20 s，此時可以獲得合適的峰形。
2.6 線性范圍、檢出限與精密度
吸取適量標準儲備液，用水稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.2、1.0、2.5、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的系列溶液,在最佳電泳條件下測定，以峰高(y)對相應(yīng)質(zhì)量濃度(x，mg/L)進行線性回歸。結(jié)果表明，ACE在0.2～100.0 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為y=1.114x+0.04，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 8，檢出限(LOD，S/N=3)為50.0 μg/L。對10 mg/L ACE標準溶液連續(xù)進樣7次，計算得到遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別為0.73%和1.8%。
圖2 泳池水樣與加標后毛細管電泳圖Fig.2 Capillary electrophoresis chromatograms of sample and standard addition
2.7 樣品分析及加標回收率
在優(yōu)化實驗條件下，樣品及樣品加標后的電泳譜圖見圖2。由圖可見，經(jīng)過固相萃取富集純化后，ACE與樣品基質(zhì)中的其他物質(zhì)實現(xiàn)了良好分離。為驗證方法的可靠性，取其中1個樣品平行測定3份，分別加入不同質(zhì)量濃度(2.5、26.0、72.0 mg/L)的標準品進行加標回收率實驗，每個質(zhì)量濃度平行測定3次，得加標回收率分別為103.6%、100.5%和96.0%。
收集石家莊市不同泳池的21個水樣，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，按“1.3”所述用Oasis?HLB固相萃取小柱濃縮富集120倍，在226 nm波長下采用毛細管電泳法在優(yōu)化實驗條件下進行分離檢測，結(jié)果如表1所示。其中15份水樣檢出ACE，質(zhì)量濃度為1.64～39.25 μg/L，所測泳池水中ACE含量高于文獻報道中加拿大泳池水的ACE檢測數(shù)據(jù)(0.03～7.11 μg/L)[13]。2016年的一項調(diào)查研究顯示中國人尿液中ACE的平均含量為4 070 μg/L[18]。由于城市自來水中ACE的含量處于很低的水平(6～15 ng/L)[13]，因此可用人尿液中乙酰磺胺酸鉀的平均含量來估計游泳池中的尿液量。
表1 實際樣品測定結(jié)果Table 1 Analytical results of real samples
*no detected
3 結(jié) 論
乙?；前匪徕浽谧詠硭腿四蛞褐袕V泛存在，可用作泳池和浴池中尿液排放的指示物。本文采用高效毛細管電泳法結(jié)合固相萃取技術(shù)，建立了游泳池水中ACE的測定新方法。該方法的加標回收率為96.0%～103.6%，遷移時間和峰高的相對標準偏差(RSD)分別為0.73%和1.8%，檢出限為50.0 μg/L。方法靈敏、準確、可靠，適用于游泳池水中ACE的檢測分析。通過ACE濃度可以估測泳池水中尿液的含量，從而為泳池水中尿液量監(jiān)測提供了更為科學(xué)和準確的途徑。
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