郭艷霞,王媛媛,李淑嫻,王文科*

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000)

黃芩是一種傳統(tǒng)的中藥材，可用于治療溫濕、暑濕、胸悶嘔惡和胎動(dòng)不安等癥狀[1],其主要成分為黃芩苷(Baicalin)和黃芩素(Baicalein,BAI)[2]。黃芩素在我國(guó)臨床上主要用于抗炎[3]、抗病毒[4-5]和抗癌[6-9]，藥效遠(yuǎn)優(yōu)于黃芩苷。目前用于BAI檢測(cè)的方法有高效液相色譜法(HPLC)[10-13]、紫外分光光度法(UV-Vis)[14]和毛細(xì)管區(qū)帶電泳-電化學(xué)檢測(cè)法(CE-ED)[15]。上述方法準(zhǔn)確高效，但存在預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、檢出限高的不足。所以建立高效、靈敏和操作簡(jiǎn)單的BAI的測(cè)定方法具有重要意義。

近年來，量子點(diǎn)[16-19](Quantum dots,QDs)的研究逐漸深入，可通過與一些物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)其表面的修飾和加工，從而形成摻雜型量子點(diǎn)[20]，進(jìn)而改變或增強(qiáng)量子點(diǎn)的原有性能。研究表明：室溫磷光(Room-temperature phosphorscence,RTP)量子點(diǎn)具有發(fā)光壽命長(zhǎng)、線性范圍寬、能夠避免體系背景熒光和散射光干擾的優(yōu)點(diǎn)，是一種測(cè)定藥物含量的新方法[21-22]。

目前，基于室溫磷光法檢測(cè)黃芩素的研究尚未見報(bào)道。本研究以水相共沉淀法合成了表面帶有正電荷的聚乙烯亞胺(PEI)包覆的錳摻雜硫化鋅量子點(diǎn)(PEI-Mn/ZnS QDs)，基于該量子點(diǎn)可與黃芩素之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，從而使得PEI-Mn/ZnS QDs室溫磷光猝滅的現(xiàn)象，建立了一種可在室溫下靈敏、快速測(cè)定黃芩素含量的磷光方法。該方法為藥品的含量標(biāo)定和快速檢測(cè)提供了新途徑。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)，Rigaku D/max-2500 X-射線衍射儀(日本Rigaku公司)，Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)(美國(guó)瓦里安公司)，PHS-3C型pH酸度計(jì)(雷磁公司)。

高純水(18.2 MΩ·cm)采用WaterPro水純化系統(tǒng)(美國(guó)Labconco公司)制備；Zn(Ac)2·2H2O、Mn(Ac)2·4H2O、Na2S·9H2O(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；BAI標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%，合肥博美生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；聚乙烯亞胺(MW=1 800，純度99.0%，廣州翔博生物技術(shù)有限公司)；黃芩飲片(北京同仁堂)和血清(服用黃芩水煎液的健康志愿者)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PEI包覆的Mn摻雜ZnS量子點(diǎn)的合成量子點(diǎn)根據(jù)文獻(xiàn)[23-24]方法略加改進(jìn)合成：于100 mL三口燒瓶中，分別加入5 mL Zn(Ac)2·2H2O(1 mmol/L)、2 mL Mn(Ac)2·4H2O(0.04 mmol/L)和PEI(0.75 g)并溶于20 mL高純水中。混勻后，用1 mol/L HCl調(diào)至pH 11.0，通氬氣攪拌10 min后將溶液加熱至80 ℃，回流30 min。迅速加入2.5 mL 0.4 mol/L的Na2S溶液，繼續(xù)攪拌回流1 h后停止加熱，待冷卻至50 ℃后用1 mol/L HCl調(diào)至pH 8.0。將得到的PEI-Mn/ZnS QDs溶液于空氣中50 ℃陳化2 h。溶液冷卻至室溫后，采用等體積的無水乙醇洗滌使量子點(diǎn)沉降，離心收集沉淀(洗滌、沉淀重復(fù)3次)，真空干燥24 h即得預(yù)制備的PEI-Mn/ZnS QDs固體。圖1分別為PEI-Mn/ZnS QDs對(duì)BAI的檢測(cè)示意圖、PEI-Mn/ZnS QDs及BAI的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1 BAI的檢測(cè)示意圖(A)、PEI-Mn/ZnS QDs(B)及黃芩素的結(jié)構(gòu)示意圖(C)Fig.1 Schematic illustration for BAI detection(A),structures of PEI-Mn/ZnS QDs(B) and BAI(C)

1.2.2測(cè)定方法在一系列10 mL比色管中，加入500 μL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH 8.0)、50 μL PEI-Mn/ZnS QDs溶液(1 mg·mL-1)和不同體積的BAI標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高純水定容至5 mL，搖勻，靜置10 min后進(jìn)行磷光分析(參數(shù)設(shè)置：選擇磷光模式；激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm；波長(zhǎng)掃描范圍為500～700 nm；激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均設(shè)為10 nm)。

1.2.3實(shí)際樣品的處理黃芩素實(shí)際樣品來自黃芩飲片，以60%的乙醇水溶液為萃取劑，將黃芩飲片于50 ℃萃取30 min即得黃芩素的檢測(cè)液。將500 μL PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH 8.0)、50 μL PEI-Mn/ZnS QDs溶液(1 mg·mL-1)、50 μL BAI檢測(cè)液加入10 mL具塞比色管中，高純水定容至5 mL，搖勻，室溫下反應(yīng)10 min后進(jìn)行分析，參數(shù)同上。血清樣品采自健康志愿者服用黃芩水煎液3 h后的血清，用高純水稀釋100倍，直接檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEI-Mn/ZnS QDs的表征

將PEI-Mn/ZnS QDs粉末分散于水中，超聲30 min，取數(shù)滴樣品分散于銅網(wǎng)上，充分干燥后采用JEM-2100透射電鏡在200 kV高速電壓下掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，量子點(diǎn)呈粒徑3 ～5 nm的均一球形(圖2A)。圖2B為PEI-Mn/ZnS QDs的粒徑分布圖，可觀察到PEI-Mn/ZnS QDs的分散效果良好，主要分布在4 nm附近。圖2C為PEI-Mn/ZnS QDs粉末的X射線衍射光譜(XRD)，(111)、(220)及(311) 3個(gè)晶面的衍射顯示PEI-Mn/ZnS QDs具有典型的立方型閃鋅礦結(jié)構(gòu)，未觀察到其他衍射峰，表明合成的量子點(diǎn)較為純凈。圖2D為PEI-Mn/ZnS QDs的紫外光譜和磷光光譜。該量子點(diǎn)的激發(fā)峰和最大發(fā)射峰分別為295 nm和585 nm，與文獻(xiàn)結(jié)果完全吻合[25],即藍(lán)色發(fā)射帶為Mn2+4T1-6A1躍遷產(chǎn)生。以上表征結(jié)果說明量子點(diǎn)已成功合成。

圖2 PEI-Mn/ZnS QDs的TEM圖(A)、粒徑分布圖(B)、XRD光譜(C)和紫外吸收光譜(曲線1)及磷光光譜圖(曲線2)(D)Fig.2 TEM image(A),the size distribution histogram(B),XRD image(C) and UV absorption(curve 1) and phosphorescence(curve 2) spectra(D) of PEI-Mn/ZnS QDs

2.2 BAI檢測(cè)條件的優(yōu)化

PEI-Mn/ZnS QDs的靈敏度和穩(wěn)定性與緩沖液體系、緩沖液pH值、反應(yīng)時(shí)間和鹽濃度有關(guān)，因此對(duì)以上因素進(jìn)行了優(yōu)化。考察了濃度和pH值相同的Tris-HCl與PBS緩沖液對(duì)反應(yīng)體系的影響(圖3A)，發(fā)現(xiàn)在Tris-HCl緩沖液中PEI-Mn/ZnS QDs的磷光強(qiáng)度弱于PBS緩沖液，且BAI猝滅量子點(diǎn)的磷光強(qiáng)度效果不靈敏。因此，實(shí)驗(yàn)選擇PBS緩沖液為最佳介質(zhì)。pH值對(duì)PEI-Mn/ZnS QDs的影響如圖3B所示：PBS緩沖液的pH值為6.0～7.0時(shí)，量子點(diǎn)的RTP強(qiáng)度隨著pH值的增大而增強(qiáng),當(dāng)pH值為7.0～8.5時(shí)，RTP強(qiáng)度較為平穩(wěn)。由于黃芩素在堿性溶液中的溶解度較好，所以選擇pH 8.0為最佳緩沖液pH值。實(shí)驗(yàn)還考察了反應(yīng)時(shí)間對(duì)PEI-Mn/ZnS QDs穩(wěn)定性的影響，結(jié)果顯示，PEI-Mn/ZnS QDs在60 min內(nèi)很穩(wěn)定，為便于快速測(cè)定，選擇反應(yīng)時(shí)間為10 min。當(dāng)PBS緩沖液的pH值為8.0，反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，考察了PEI-Mn/ZnS QDs在不同NaCl濃度(0～0.1 mol/L)范圍內(nèi)的磷光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，在0～0.1 mol/L NaCl濃度范圍內(nèi)，PEI-Mn/ZnS QDs的磷光強(qiáng)度信號(hào)較穩(wěn)定，所以在實(shí)際操作中無需考慮NaCl對(duì)反應(yīng)體系的影響。

2.3 工作曲線與檢出限

實(shí)驗(yàn)首先探究了BAI對(duì) PEI-Mn/ZnS QDs磷光發(fā)射光譜的影響。圖4A顯示,PEI-Mn/ZnS QDs的RTP信號(hào)強(qiáng)度隨BAI質(zhì)量濃度的增加而減小，說明BAI猝滅了PEI-Mn/ZnS QDs的磷光。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，PEI-Mn/ZnS QDs的磷光猝滅程度(P0/P)與BAI質(zhì)量濃度在0.07～0.60 mg·L-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(圖4A插圖)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為P0/P=3.677 9CBAI(mg·L-1)+0.488 3，相關(guān)系數(shù)(r)為0.997。以11次平行測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算，得到檢出限(3σ)為0.039 mg·L-1。對(duì)不含BAI和含有0.2 mg·L-1BAI的PBS緩沖液(0.2 mol/L,pH 8.0)+PEI-Mn/ZnS QDs(1 mg·mL-1)檢測(cè)體系連續(xù)11次平行測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.1%。圖4B為PEI-Mn/ZnS QDs與BAI的共振光散射譜圖，在未加BAI時(shí)，單獨(dú)量子點(diǎn)的共振光散射較弱，隨著BAI的加入，共振光散射強(qiáng)度隨之增加。由于量子點(diǎn)最外層帶有陽(yáng)離子，BAI最外層帶有陰離子，兩者之間可通過靜電引力的作用形成疏水性較強(qiáng)的化合物，在疏水作用與分子間作用力下，PEI-Mn/ZnS QDs與BAI聚集形成納米復(fù)合物，致使體系的共振光散射顯著增強(qiáng)。與已有方法相比，此方法靈敏度高、快速簡(jiǎn)單，對(duì)比結(jié)果見表1。

MethodLinear range(mg·L-1)Limit of detection(mg·L-1)CharacterisiticReferenceHPLC(高效液相色譜法)1.840～30.600 2.140靈敏度高,操作復(fù)雜,儀器昂貴[10]UV-Vis(紫外分光光度法)1.690～6.760 0.270靈敏度較高,操作復(fù)雜[14]CE-ED(毛細(xì)管區(qū)帶電泳-電化學(xué)檢測(cè)法)0.140～270.0000.060靈敏度高,需堿性環(huán)境[15]PEI-Mn/ZnS QDs-RTP(本方法)0.070～0.6000.039靈敏度高,操作簡(jiǎn)單快速,無需預(yù)處理,成本低This work

2.4 共存物質(zhì)的影響

考察了常見離子和物質(zhì)對(duì)PEI-Mn/ZnS QDs檢測(cè)黃芩素含量的影響。檢測(cè)了1 000倍的Mg2+，500倍的甘氨酸、Na+、K+，300倍的葡萄糖、蔗糖、L-脯氨酸，150倍的Ca2+、谷氨酸、精氨酸，50倍的草酸和10倍黃芩苷對(duì)0.5 mg ·L-1黃芩素測(cè)定的影響。結(jié)果表明：以上物質(zhì)對(duì)PEI-Mn/ZnS QDs的室溫磷光強(qiáng)度影響不大,相對(duì)誤差均在5%以內(nèi)。說明PEI-Mn/ZnS QDs可對(duì)BAI進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

按“1.2.3”方法對(duì)黃芩飲片和血清進(jìn)行處理后，進(jìn)行2個(gè)濃度水平(1.00、2.00 mg·L-1)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，黃芩飲片的加標(biāo)回收率分別為97.2%和100.7%；血清的加標(biāo)回收率分別為96.0%和98.0%。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)黃芩飲片和血清中黃芩素在24 h內(nèi)每隔3 h測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定8次，日內(nèi)RSD分別為2.8%和3.4%；將黃芩飲片和血清中黃芩素溶液密封室溫保存7 d，每天測(cè)量1次，得日間RSD分別為3.3%和4.7%，說明該檢測(cè)體系具有較好的精密度。

2.6 BAI與PEI-Mn/ZnS QDs的作用機(jī)制研究

圖5 磷光猝滅的Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線Fig.5 Stern-Volmer plot and Lineweaver-Burk plot of phosphorescence quenching

BAI可以猝滅磷光，表明PEI-Mn/ZnS QDs與BAI之間發(fā)生了相互作用。磷光猝滅過程分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動(dòng)態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程：P0/P=1+KSVCq；靜態(tài)猝滅遵循Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線:1/(P0-P)=1/P0+KLB/(P0Cq)。式中，P0為磷光體的磷光強(qiáng)度；P為加入磷光猝滅劑后體系的磷光強(qiáng)度；Cq為猝滅劑濃度；KSV為Stern-Volmer常數(shù)；KLB為靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)。圖5為擬合的Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)曲線，P0/P與BAI的濃度呈明顯的線性關(guān)系,符合Stern-Volmer方程，即猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅。

可以推測(cè)PEI-Mn/ZnS QDs與BAI的反應(yīng)機(jī)理為：在溶液中，BAI為一種電子受體，帶負(fù)電荷，而PEI-Mn/ZnS QDs帶正電荷，BAI可通過靜電作用與PEI-Mn/ZnS QDs產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移，致使PEI-Mn/ZnS QDs的磷光猝滅(如圖6)。

圖6 PEI-Mn/ZnS QDs檢測(cè)黃芩素的原理Fig.6 Principle of PEI-Mn/ZnS QDs for detection of BAI

3 結(jié) 論

本文基于BAI對(duì)PEI-Mn/ZnS QDs的室溫磷光猝滅機(jī)制，建立了BAI濃度的檢測(cè)方法，其檢出限低至0.039 mg·L-1，線性范圍為0.07～0.60 mg·L-1?；诹孔狱c(diǎn)的RTP檢測(cè)方法無需復(fù)雜預(yù)處理，且能夠避免中藥提取液以及生物自身體液背景熒光和散射光的干擾，該方法可用于中藥材及生物體液中黃芩素含量的檢測(cè)。