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(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖教研室，福建 泉州 362010；2.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校動物實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362010)

精索靜脈曲張(varicocele，VC)是一種發(fā)生于精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的血管病變，是導(dǎo)致疼痛、不適及進(jìn)行性睪丸功能減退的重要原因，也是導(dǎo)致男性不育的最常見原因之一[1]。支持細(xì)胞在精子的生成中具有重要作用，是為發(fā)育中的精子提供保護(hù)和營養(yǎng)的細(xì)胞[2]。男性不育治療的研究一直是熱點(diǎn)，但相關(guān)西醫(yī)療法效果不佳，近年來中醫(yī)中藥研究取得了一定進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)巴戟天(morindaofficinalis)具有提升性功能強(qiáng)度的作用，在治療VC中有具有較好療效，這可能與巴戟天具有改善波形蛋白(vimentin)表達(dá)水平的作用有關(guān)，但關(guān)于其治療機(jī)理的相關(guān)研究極少[3-4]。本文應(yīng)用動物建模實(shí)驗(yàn)研究巴戟天水提取物對精索靜脈曲張SD大鼠支持細(xì)胞波型蛋白表達(dá)的影響，探究巴戟天治療VC的機(jī)理，為巴戟天治療VC在臨床上的推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

選取處于青春期的健康雄性SD大鼠40只作為研究對象，平均體質(zhì)量(195.86±13.86)g，按照數(shù)字隨機(jī)表法分為假手術(shù)組(假手術(shù)組)、VC+生理鹽水組(對照組)、VC+巴戟天水提取物200 mg/kg組(觀察1組)以及VC+巴戟天水提取物400 mg/kg組(觀察2組)，每組10只。除假手術(shù)組外，均對腎靜脈給予逆行結(jié)扎，形成VC模型。在VC模型形成30 d后，觀察1組、觀察2組按照不同組別分別使用不同劑量巴戟天水提取物進(jìn)行灌胃，假手術(shù)組、對照組使用同體積生理鹽水進(jìn)行灌胃，時(shí)間持續(xù)30 d。頸椎脫臼處死VC模型SD大鼠后取出睪丸，剔出膜組織，剪碎后使用D-Hanks除去清液，將組織分別使用0.25%胰蛋白酶、0.10%膠原酶I型消化，將懸濁液使用200目的細(xì)胞篩過濾，使用高速離心機(jī)離心10 min(1 500 r/min)，使用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞密度。

1.2 細(xì)胞活性檢測

使用MTT法檢測細(xì)胞活性，將每份細(xì)胞懸液樣本于96孔板中培養(yǎng)，每孔加入20 μg濃度為5 mg/mL的MTT溶液，震蕩30 s后在5%CO2、35 ℃條件下培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)后吸去每孔上清液，每孔加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，使用酶標(biāo)儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光度(absorbance，A)，細(xì)胞存活率=[(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A假手術(shù)組-A空白組)]×100%。

1.3 支持細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平

1.3.1 總RNA提取 細(xì)胞懸液加入Trizol裂解后加入三氯甲烷震蕩1 min后在0 ℃下靜置5 min，并在4 ℃下離心15 min(15 000 r/min)，收集上清液分別使用異丙醇、乙醇使用離心法洗滌，最后加入DEPC水溶解得到RNA溶液。使用核酸蛋白儀檢測RNA純度，A在1.8～2.0視為RNA純度較高。

1.3.2 使用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA 使用反轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，試劑盒購買于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，嚴(yán)格按照說明書操作進(jìn)行。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 本次演技引物參照相關(guān)文獻(xiàn)[5]，引物長度為150 bp，上游：5-ATGAAAGTGTGGCTGCCAAGAAC-3’，下游：5’-GTGACTGCACCTGTCTCCGGTA-3’。

1.3.4 檢測mRNA相對表達(dá)量 使用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(real-time quantitative PCR)法檢測，試劑盒購買于伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司，將稀釋后的cDNA樣本2 μL以及引物各2 μL建立反應(yīng)體系(10 μL)，按照以下條件孵化，50 ℃、2 min，95 ℃、2 min，60 ℃、1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，使用2-△△Ct法計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

1.4 支持細(xì)胞波形蛋白表達(dá)水平

使用Western blotting法檢測波形蛋白表達(dá)，方法如下：使用胰酶消化后使用苯甲基磺酰氟裂解細(xì)胞30 min，后在4 ℃條件下離心10 min(15 000 r/min)，收集上清液，蛋白定量方法為BCA法。配制基層膠(60 V、30 min)和分離膠(100 V、60 min)，封閉后分別加入兔抗大鼠Vimentin單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃孵化12 h，TBST洗滌，入羊抗兔IgG(1∶3 000)，25 ℃孵化1 h，TBST洗滌，進(jìn)行電泳，將電泳結(jié)果拍照，使用Quantity One軟件分析波形蛋白相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠支持細(xì)胞活性比較

4組支持細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 4組大鼠支持細(xì)胞活性比較(n=10)

2.2 4組大鼠支持細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平比較

對照組支持細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，觀察1組和觀察2組波形蛋白mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，并且觀察2組顯著高于對照組和觀察1組(P<0.05)，見表2。

組別相對表達(dá)水平t/P假手術(shù)組1.00±0.00對照組0.47±0.06t1=11.435,P1=0.000觀察1組0.72±0.11t1=7.867,P1=0.000; t2=7.128,P2=0.000觀察2組0.89±0.12t1=3.947,P1=0.000; t2=10.464,P2=0.000; t3=5.751,P3=0.000

t1、P1:與假手術(shù)組比較；t2、P2:與對照組比較；t3、P3:與觀察1組比較

2.3 4組大鼠支持細(xì)胞波形蛋白表達(dá)水平比較

支持細(xì)胞的波形蛋白表達(dá)凝膠電泳圖見圖1，對照組支持細(xì)胞波形蛋白表達(dá)水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，觀察1組和觀察2組波形蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05)，并且觀察2組顯著高于對照組和觀察1組(P<0.05)，見表3。

圖1 支持細(xì)胞波形蛋白凝膠電泳圖

表3 4組支持細(xì)胞波形蛋白表達(dá)水平比較)

t1、P1:與假手術(shù)組比較；t2、P2:與對照組比較；t3、P3:與觀察1組比較

3 討論

VC是一種血管病變，精索內(nèi)蔓狀靜脈叢的異常擴(kuò)張、伸長和迂曲，由于包繞精索的精索靜脈和蔓狀靜脈叢的擴(kuò)張而引起的血管性精子發(fā)生障礙，不但會使患者感覺疼痛，而且導(dǎo)致不育，給患者、家庭和社會帶來不利因素。VC在在男性不育癥中占19%～41%[6]。目前對于VC的治療主要為護(hù)理性治療、藥物治療以及手術(shù)治療，其中一般護(hù)理性治療主要為飲食調(diào)節(jié)、注意生活方式、降溫或陰囊托等，此類方法療效不理想；手術(shù)方法主要為經(jīng)腹股溝管精索內(nèi)靜脈高位結(jié)扎術(shù)、經(jīng)腹膜后精索內(nèi)靜脈高位結(jié)扎等，雖具有一定效果，但患者選擇時(shí)出于安全性考慮較為猶豫；藥物治療主要為中藥治療，療效較好，但其治療機(jī)理一直是研究熱點(diǎn)[7-8]。

巴戟天為為雙子葉植物茜草科，巴戟天水提取物中的主要成分為巴戟天多糖、甲基異茜草素、甲基異茜草素-1-甲醚等蒽醌物質(zhì)，在中醫(yī)中常用于治療主治陽痿遺精、宮冷不孕等生殖問題[9]。研究發(fā)現(xiàn)巴戟天可提高VC大鼠緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)提高支持細(xì)胞的緊密連接作用[10]。支持細(xì)胞不是生殖細(xì)胞株的一部分，但支持細(xì)胞曲細(xì)精管中緊鄰生殖細(xì)胞，為精子提供保護(hù)和營養(yǎng)，支持細(xì)胞不但在間質(zhì)間隙與浸泡生殖上皮的液體之間起功能性屏障作用，還具有分泌介質(zhì)促進(jìn)精子產(chǎn)生和成熟、吞噬發(fā)育不良的精子、分泌睪網(wǎng)液促進(jìn)精子的排出等作用[11]。研究發(fā)現(xiàn)VC導(dǎo)致的支持細(xì)胞發(fā)育異常是導(dǎo)致不育的重要原因[12]。波形蛋白具有維持細(xì)胞骨架的完整性的作用[13]。有研究顯示VC大鼠的波形蛋白mRNA表達(dá)水平低于健康大鼠，提示可能由于VC導(dǎo)致波形蛋白表達(dá)分泌異常，導(dǎo)致支持細(xì)胞體積失去支持，出現(xiàn)胞體變小、形態(tài)異常，從而影響支持細(xì)胞功能，影響精子的生成[14-15]。

本次研究結(jié)果顯示，經(jīng)巴戟天灌胃治療大鼠的支持細(xì)胞活性與假手術(shù)組相比無顯著差異，說明巴戟天水提取物具有一定的安全性。對照組的波形蛋白mRNA表達(dá)水平以及波形蛋白表達(dá)水平均顯著低于假手術(shù)組，驗(yàn)證了VC會引起波形蛋白表達(dá)異常，與過往研究結(jié)果一致[16]。觀察1組和觀察2組波形蛋白mRNA表達(dá)水平和波形蛋白表達(dá)水平顯著高于對照組，并且觀察2組顯著高于對照組和觀察1組，說明巴戟天水提取物具有提高波形蛋白表達(dá)的作用，隨著劑量的增加，這種效果越明顯。Ghaffari等[17]研究發(fā)現(xiàn)VC的波形蛋白表達(dá)水平顯著低于健康人群，而通過治療可使波形蛋白水平顯著升高，療效佳組波形蛋白水平升高更加顯著。李容等[18]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天水、醇 提物對手機(jī)輻射致大鼠生殖障礙有修復(fù)功效，且水提物效果優(yōu)于醇提物。王鳳娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)巴戟天水提物可促進(jìn)微波輻射大鼠睪丸的修復(fù)和促進(jìn)精子生成,巴戟天醇提物可改善損傷的大鼠睪丸生精細(xì)胞的形態(tài),而對精子的生成作用不明顯，但可顯著下調(diào)下丘腦GnRH的表達(dá)提示巴戟天水提取物中的活性成分可通過提高波形蛋白的表達(dá)促進(jìn)支持細(xì)胞的生長分化，保持支持細(xì)胞正常的大小、形態(tài)，恢復(fù)支持細(xì)胞功能，并恢復(fù)支持細(xì)胞與生精細(xì)胞間的連接，從而治療VC導(dǎo)致的不育癥狀[18-20]。綜上所述，巴戟天水提取物具有提高VC大鼠支持細(xì)胞波形蛋白mRNA表達(dá)水平和波形蛋白表達(dá)水平的作用，并且對細(xì)胞活力無明顯影響。