，棟梁， ，

(重慶涪陵中心醫(yī)院燒傷整形科， 重慶 408000)

口腔癌發(fā)病率位居頭頸部惡性腫瘤首位，占人類惡性腫瘤發(fā)病率的3%，全球每年平均新增10萬例新患者[1]?？谇击[狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是具有不同程度鱗狀分化的上皮侵襲性腫瘤，約占所有類型口腔癌總數(shù)的90%[2]。目前針對口腔鱗癌的治療以手術(shù)、放化療相結(jié)合的個體化綜合療法為主，但仍有較多患者在綜合治療后出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移，其5年生存率僅為50%[2]。因此，深入探究口腔鱗狀細胞癌遠處侵襲轉(zhuǎn)移的機制十分有必要。惡性腫瘤在生長過程中逐漸產(chǎn)生全身遠處侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復雜的過程，受到多種因素在多個不同階段的序貫調(diào)控。近年來，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)逐漸引起國內(nèi)外學者的高度關(guān)注，這一過程與惡性腫瘤的遠處擴散轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。EMT是指細胞在某些特殊的生理、病理生理條件下，受到內(nèi)源性或外源性刺激，使得上皮細胞失去其上皮特征，并逐漸獲得間質(zhì)特性的過程[3-4]。上皮細胞喪失原本存在的極性、進而解除與周圍細胞之間的連接并與細胞基質(zhì)的接觸減少、細胞骨架改變，同時伴隨著細胞遷移和運動能力增強，這些都是EMT的特征性變化。EMT不僅參與胚胎早期發(fā)育和器官生成，同時也通過促進細胞侵襲轉(zhuǎn)移從而參與許多惡性上皮腫瘤發(fā)展的過程[5]。

轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)是一種被證實能夠被不同細胞分泌的有著廣泛生物學效應的細胞因子，不僅在細胞的分裂與增殖過程中發(fā)揮重要作用，而且與新生血管形成和惡性腫瘤的發(fā)生等過程緊密相關(guān)[6-7]。此外，研究表明TGF-β信號通路的異常激活也參與了EMT 過程[8-9]。然而在具有高度侵襲性的口腔鱗癌中，EMT是否參與其遠處侵襲轉(zhuǎn)移過程，以及TGF-β1在這一生物學事件中的調(diào)控作用目前鮮有報道。本文旨在研究TGF-β1誘導人口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞發(fā)生EMT及對細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

人口腔鱗狀細胞癌Tca8113細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所；TGF-β1購自R&D公司；TGF-β1抑制劑LY2109761購自Selleck公司；TRIzol RNA 提取試劑購自Takara 公司；本研究所有PCR引物的設計與合成均委托上海擎科生物公司完成；多克隆兔抗人E-cadherin、Vimentin、GAPDH一抗購自美國Santa Cruz公司；辣根酶標記羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司； Protein marker 購自Thermo Fisher公司；ECL 發(fā)光試劑盒購自Millipore公司；小牛血清購自GIBCO 公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HYCLONE公司；24孔transwell小室(孔徑8 μm)購自Corning Costar公司；細胞基質(zhì)膠(Matrigel)購自BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

Tca8113細胞株在37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件的細胞培養(yǎng)箱中用含10%小牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。當細胞鋪滿瓶底60%后，改換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基對細胞進行饑餓處理(6～8 h)，再加入TGF-β1處理24 h。

1.3 細胞形態(tài)學觀察

將長滿的Tca8113細胞消化、傳代種于6孔板，待其貼壁后用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓處理6～8 h。第二日使用TGF-β1對細胞處理48 h后在普通倒置光學顯微鏡下觀測Tca8113細胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 RNA 提取和real-time PCR 檢測

使用冰上預冷PBS洗滌將處理完成的細胞洗滌3次，隨后每個孔分別加入1 mL Trizol溶液，提取細胞總RNA為后續(xù)實驗做準備。PCR 所用引物由上海擎科生物科技公司上海分公司合成，引物序列如下：GAPDH 上游引物5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’，下游引物5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ ； Vimentin 上游引物5’-CCAAACTTTTCCTCCCTGAACC-3’，下游引物5’-GTGATGCTGAGAAGTTTCGTTGA-3’ ；E-cadherin 上游序列5’-GTACTTGTAATGACACATCTC-3’；下游引物5’-TGCCAGTITCTGCATCTGC-3’。反應條件均為95 ℃、3 min 預變性；94 ℃、30 s ；48 ℃、30 s，72 ℃、1 min，擴增35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 Western blot檢測

將已處理好的口腔鱗癌Tca8113細胞系用PBS洗滌3次隨后加入RIPA裂解液并用細胞刮刀刮下來放入1.5 mL EP管中冰上裂解30 min。隨后于12 000 r/min離心10 min并將蛋白上清液凍存于-20 ℃。使用 5×蛋白上樣緩沖液混勻蛋白上清后于95 ℃中加熱10 min，待其充分變性。上機跑電泳，隨后轉(zhuǎn)膜并置于5%脫脂牛奶中封閉1 h。封閉結(jié)束后使用TBST洗膜5 min×3次，隨后將膜置于多克隆兔抗人的GAPDH、Vimentin、E-cadherin(濃度均為1∶1 000)中4 ℃孵育過夜。次日，洗膜5 min×3次后，置于辣根酶標記羊抗兔IgG中室溫孵育2 h。TBST洗膜5 min×3次后，采用ECL化學發(fā)光法金鼎顯影。應用Quantity One軟件分析條帶灰度值并作統(tǒng)計分析。

1.6 細胞遷移與侵襲實驗

將Matrigel膠 (matrigel原液與無血清培養(yǎng)基之比為1∶3)鋪在小室上面，置于37 ℃培養(yǎng)箱中待用。將口腔鱗癌Tca8113細胞系在無血清RMPI-1640培養(yǎng)基中饑餓處理6 h后，將其消化、重懸，上室加入無血清細胞懸液200 μL(細胞量4×105/mL)，下室加入含20%FBS的RMPI-1640培養(yǎng)基，每孔600 μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。處理完成后取出小室，用PBS洗滌3次，并用濕棉簽輕柔擦除上室面的細胞，隨后置于4%多聚甲醛中固定20 min。取出室溫下風干3～5 min，隨后置于結(jié)晶紫染料中染色15 min。最后用PBS洗滌3次，并置于倒置顯微鏡下觀察穿過微孔膜的細胞數(shù)量，并進行統(tǒng)計分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1促進上皮樣Tca8113細胞向間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)化

Tca8113 細胞經(jīng)過10 ng/mL濃度TGF-β1刺激24 h 后，在普通倒置光學顯微鏡下觀察拍照發(fā)現(xiàn)，Tca8113細胞在對照組中形態(tài)為典型的上皮樣結(jié)構(gòu)，而經(jīng)10 ng/mL TGF-β1處理的Tca8113細胞大部分細胞形態(tài)變?yōu)榧氶L梭形，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細胞形態(tài) (圖1)。

a：空白對照組(0 ng/mL TGF-β1)；b: TGF-β1處理組(10 ng/mL TGF-β1)；c: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組(10 ng/mL TGF-β1+LY2109761)

圖1Tca8113細胞經(jīng)10ng/mL濃度TGF-β1處理24h后的形態(tài)學變化(×400)

2.2 TGF-β1對Vimentin、E-cadherin mRNA表達的影響

經(jīng)過不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL)TGF-β1處理24 h后，RT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組相比，TGF-β1刺激后Tca8113細胞TGF-β1處理組的上皮標記蛋白E-cadherin mRNA表達量隨藥物濃度的增加而下降，而間質(zhì)標記蛋白Vimentin mRNA的表達量卻隨藥物濃度的增加而逐步增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

a:E-cadherin mRNA相對表達量;b:Vimentin mRNA相對表達量 *：與0 ng/mL TGF-β1比較，P<0.05；**：與0 ng/mL TGF-β1比較，P<0.01

圖2Tca8113細胞經(jīng)不同濃度TGF-β1處理24h后E-cadherin和VimentinmRNA的表達量

2.3 TGF-β1對Vimentin、E-cadherin 蛋白表達的影響

不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL)TGF-β1處理Tca8113 細胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示TGF-β1刺激后，Tca8113細胞上皮標記蛋白E-cadherin表達量隨TGF-β1濃度的增加而下降，而間質(zhì)標記蛋白Vimentin的表達量卻隨TGF-β1濃度的增加相應增加, 差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 TGF-β1抑制劑逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

使用10 ng/mL TGF-β1處理處理Tca8113 細胞24 h后，與對照組相比，上皮表型E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平明顯下降，間質(zhì)表型Vimentin的mRNA和蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而加用10 ng/mL濃度TGF-β1抑制劑LY2109761則顯著逆轉(zhuǎn)這EMT現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 TGF-β1促進Tca8113 細胞遷移

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理24 h后，與對照組相比TGF-β1處理組中Tca8113細胞的遷移能力顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加用TGFβ1特異抑制劑LY2109761能夠逆轉(zhuǎn)這一過程，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5。

2.6 TGF-β1促進Tca8113 細胞侵襲

在Transwell小室遷移實驗中，我們發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理24 h后，與對照組相比TGF-β1處理組中Tca8113細胞的侵襲能力顯著增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加用TGFβ1特異抑制劑LY2109761能夠逆轉(zhuǎn)這一過程，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖6。

3 討論

口腔鱗狀細胞癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤，具有惡性程度高、局部生長迅速、晚期易于侵襲轉(zhuǎn)移及復發(fā)等生物學特點[10-12]。惡性腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移過程受到多基因、多因素互相調(diào)控，包括以下幾個階段：腫瘤細胞首先從原發(fā)病脫離，隨后隨著血液循環(huán)到遠處定植生長成為轉(zhuǎn)移灶，在這個過程中其是通過局部浸潤、血行轉(zhuǎn)移、細胞增殖等步驟來序貫實現(xiàn)的[13-15]。如何早期發(fā)現(xiàn)和阻斷該腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及應用有效的治療方法是預防與治療口腔鱗癌的關(guān)鍵所在。

a:Wester blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達;b:E-cadherin相對表達量;c:Vimentin相對表達量 *:與0 ng/mL TGF-β1處理組比較，P<0.05;**:與0 ng/mL TGF-β1處理組比較，P<0.01

圖3Tca8113細胞經(jīng)不同濃度TGF-β1處理24h后E-cadherin和Vimentin蛋白的表達量

a:Wester blot檢測E-cadherin、Vimentin蛋白表達;b:E-cadherin相對表達量;c:Vimentin相對表達量 *：P<0.05；**：P<0.01

a：空白對照組；b: TGF-β1處理組；c: TGF-β1+LY2109761組；d: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組

a：空白對照組；b: TGF-β1處理組；c: TGF-β1+LY2109761組；d: TGF-β1+TGF-β1 siRNA組

越來越多的研究結(jié)果表明，EMT 廣泛參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移生物學過程，包括乳腺癌、宮頸癌、肝癌、結(jié)腸等[16-18]。Greenburg等[19]在實驗中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的上皮來源細胞逐漸獲得間質(zhì)細胞的特性，在這一基礎上首次證實EMT的發(fā)生。 EMT在胚胎和器官的發(fā)育、多種纖維化疾病以及惡性腫瘤發(fā)病等過程中都發(fā)揮著重要作用。目前，口腔鱗狀細胞癌中的EMT 研究報道較少。有學者使用免疫組織化學方法檢測發(fā)現(xiàn)，在口腔鱗狀細胞癌組織中EMT相關(guān)指標snail和Slug呈高表達，而上皮表型E-cadherin呈低表達，并且snail、slug與E-cadherin呈負相關(guān)，而與患者的預后成正相關(guān)[20-22]。Krisanaparkornkit等[23]采用Western blot和明膠酶譜法分別檢測不同類型口腔鱗癌細胞株(HN008、HN5 和HN6、HN15)中EMT與侵襲相關(guān)指標的表達情況，在多種細胞株中檢測到E-cadherin、MMP-9的表達下調(diào)和Vimentin、MMP-2的表達上調(diào)。整合素尤其是αVβ6 整合素在EMT中起重要作用，有學者發(fā)現(xiàn)在口腔鱗狀細胞癌中完整的β6 亞基能夠誘導EMT的發(fā)生，上調(diào)vimentin的表達，減少cytokeratin和E-cadherin的表達，而表達不完整β6亞基的口腔鱗癌細胞能夠保持其上皮特性并不改變vimentin或E-cadherin的表達[24]。以上研究證實EMT參與了口腔鱗癌的發(fā)病過程，但是口腔鱗癌中EMT程序是如何啟動的及其對腫瘤細胞的生物學功能有何影響，目前鮮有報道。

TGF-β1是TGF-β超家族的重要成員之一，是一類具有多種生物學活性的細胞因子, 對細胞侵襲、凋亡、衰老以及分化等重要的生理過程進行調(diào)節(jié)[25-26]。EMT 的發(fā)生是一個復雜的過程，涉及眾多分子和信號通路, TGF-β1信號通路在EMT的啟動和發(fā)展過程中作為主要誘導劑發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-28]。多個系列研究證明，TGF-β信號通路的異常激活是惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控因子[29]。腫瘤細胞內(nèi)經(jīng)?？蓹z測到活化TGF-β 的產(chǎn)生增加；這不僅觸發(fā)EMT程序的啟動、增強其侵襲轉(zhuǎn)移能力，而且也與腫瘤微環(huán)境局部的新生毛細血管形成有關(guān)，后者可為發(fā)生遷移的腫瘤間質(zhì)細胞提供營養(yǎng)支持[30-31]。由于TGF-β 引發(fā)的EMT 針對不同類型的上皮細胞具有不同的特點，因此，TGF-β 誘導EMT 發(fā)生的機制在不同的腫瘤發(fā)生過程中確實存在著差異。目前關(guān)于TGF-β1能否誘導人口腔鱗狀細胞癌Tca8113 細胞發(fā)生EMT，尚未見報道。因此，基于以上研究發(fā)現(xiàn)，我們推測TGF-β1通過誘導人口腔鱗癌Tca8113 細胞EMT的發(fā)生，使其侵襲轉(zhuǎn)移增加，導致腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移。

在本項研究中，我們首先驗證了TGF-β1是否能夠誘導Tca8113 細胞EMT的發(fā)生。結(jié)果表明，使用10 μg/L TGF-β1處理24 h后，大部分Tca8113細胞的形態(tài)與對照組相比明顯拉長呈長梭形，呈現(xiàn)散在生長狀態(tài)。這一結(jié)果表明TGF-β1能夠誘導典型的EMT的發(fā)生。在EMT發(fā)生時，E-cadherin 作為上皮間黏附的主要標記蛋白其表達下調(diào)，而間質(zhì)表型蛋白vimentin的上調(diào)使細胞相互之間的黏附力下降，使細胞的運動能力明顯增強，進而引起局部腫瘤細胞向外周浸潤生長及轉(zhuǎn)移。接下來我們在mRNA和蛋白水平分別驗證受TGF-β1刺激的Tca8113細胞是否發(fā)生EMT。經(jīng)過不同濃度(0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL)TGF-β1處理24 h后，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示5 ng/mL濃度的TGF-β1處理24 h后，Tca8113細胞E-cadherin的mRNA和蛋白表達水平最低，而Vimentin的mRNA和蛋白表達水平最高，這一結(jié)果表明TGF-β1成功誘導Tca8113 細胞EMT的發(fā)生。在證實TGF-β1的確能夠啟動EMT程序之后，我們在此基礎上采用Transwell小室實驗檢測Tca8113細胞遷移和侵襲能力的變化。經(jīng)過5 ng/mL濃度TGF-β1處理24 h后，TGF-β1處理組Tca8113細胞體外遷移及侵襲能力顯著增強，而TGF-β1抑制劑LY2109761則有效減弱這一效應。這一結(jié)果進一步證實TGF-β1通過啟動EMT程序進而促進Tca8113細胞的體外遷移與侵襲能力。本研究存在以下不足之處：①驗證了TGF-β1誘導的口腔臨床細胞癌EMT，但TGF-β1調(diào)控口腔鱗狀細胞癌EMT發(fā)生的具體調(diào)控機制目前尚不清楚。有研究表明在乳腺癌中能夠促進ZEB1 和ZEB2 的表達，抑制E-cadherin 的表達。同時沉默這兩種轉(zhuǎn)錄因子能完全抵消TGF-β1對E-cadherin的抑制作用，而間質(zhì)標志蛋白，如N-cadherin和Vimentin則不受ZEB1和ZEB2沉默的影響。因此，在后續(xù)研究中我們將針對TGF-β1對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用做進一步研究；②只應用一種細胞系來進行驗證，在后續(xù)的深入研究中我們將采用兩種以上的細胞系來進行實驗，使研究結(jié)果更有說服力。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)在口腔癌Tca8113細胞系中TGF-β1能夠啟動EMT程序，從而顯著促進細胞侵襲和遷移能力，這為口腔鱗癌的高侵襲性提供新的理論支持。因此，深入研究EMT在口腔鱗癌發(fā)病中的作用機制，通過干預以及逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的EMT進程，削弱惡性腫瘤細胞的侵襲潛能，這將為口腔鱗癌的個體化治療提供新的思路和依據(jù)。