薛霖莉，冀云燕，郝曉靜，曹靖，任華偉，李藝雷，耿建軍，王海東，赫曉燕*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 信息學院，山西 太谷 030801；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院 畜牧獸醫(yī)系，北京 102442)

MyoD基因是MRFs(myogenic regulator factors)基因家族的一個調控因子，截至目前MRFs基因家族共有4個成員：生肌決定因子(MyoD)、肌細胞生成素(MyoG)和生肌調節(jié)因子5(Myf5)、生肌調節(jié)因子4(MRF4/Myf6)[1]。MyoD基因控制著肌細胞的增殖分化[2]是肌肉成長過程中最早開始表達的基因，MyoD基因在肌肉整個生長過程中都在發(fā)揮著作用,且肌肉分化末期表達量達到最高。MyoD基因作用的過程是與家族成員以及其它調節(jié)因子相互協(xié)同完成，以達到對肌肉發(fā)育精確調控[3]。

生肌調節(jié)因子家族，目前已知的4種調節(jié)因子都屬于磷酸蛋白類。它們共同的結構都是含有氨基酸組成的高同源片段，該片段里已證實有70個殘基組成，顯堿性的精氨酸和賴氨酸形成堿性區(qū)，大約6個保守氨基酸構成螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(bHLH：basic helix loop helix)結構。堿性區(qū)是基因的啟動子或增強子的結合部位；bHLH結構是一個保守結構，其它調控因子家族也含有該結構，對于基因結合起著介導作用，在生物體的生長發(fā)育調控中具有著極其重要的地位[3]。MRFs基因家族是機體通過反式激活作用來調控肌肉表達的，主要發(fā)揮作用的位點在MRFs基因的堿性區(qū)，bHLH結構是發(fā)揮作用的前提。bHLH結構正好形成二聚體且4個螺旋平行排列時，堿性區(qū)才能結合DNA發(fā)揮作用，MRFs基因才能表達調控[1]。

MyoD基因的表達調控是目前研究的熱點，Davis等[4]在1987年首次克隆出MyoD基因，發(fā)現(xiàn)該基因對于骨骼肌的分化很重要，在組織修復方面不可或缺；1988年和1999年Braun等和Weintraub等人運用雜交的方法將MyoD基因定位在人的11號染色體上，隨后又在小鼠上定位至1號染色體上；1990年，Weintraub等通過結構比對的方法找出了MRFs家族的另外家族成員[5]。MyoD基因在心肌中的表達定位以及對心肌分化發(fā)育中調控作用目前研究很少，本試驗通過選取幼年、性成熟、體成熟、老年4組小鼠進行心肌MyoD基因的表達定位進行研究，以期闡釋MyoD基因表達與心肌分化發(fā)育的相關性[6]，為進一步研究肌肉作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

不同發(fā)育階段的小鼠共12只(由山西農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心提供)，分別為幼齡小鼠(1周齡)3只，性成熟小鼠(3～4周齡)3只，體成熟小鼠(8周齡)3只和老齡小鼠(12月齡)3只。

1.2 試驗主要儀器和試劑

主要儀器：組織包埋機、烤片機、組織切片機、光學顯微鏡、普通PCR儀(Bio-rad；美國)、XB70制冰機(格蘭特儀器廠；寧波)、高速冷凍離心機(sigma；德國)、PCR電泳儀(六一儀器廠；北京)、凝膠成像系統(tǒng)(Panasonic)、超凈工作臺(SW-CJ-CO型；蘇州)。

主要試劑：固定液、酒精、二甲苯、中性樹脂、蘇木精、伊紅、蒸餾水、瓊脂粉、異丙醇、氯仿、PBS緩沖劑、免疫組織化學試劑盒、飽和苦味酸、冰醋酸、甲醛、顯色劑(DAB/AEC)、SYBR、ROX、RNAiso。

2 試驗方法

2.1 取樣

手術摘除取幼年鼠、性成熟鼠、體成熟鼠和老年鼠心臟，取部分組織置于Bouins氏固定液中室溫固定24 h，進行固定用于制作石蠟切片，隨后進行HE染色和免疫組化，部分組織于液氮中進行保存，用于總RNA的提取。

2.2 總 RNA 的提取及 cDNA 的合成

采用Trizol 法對小鼠心肌組織總 RNA進行提取，通過瓊脂糖電泳鑒定其完整性。 心肌組織 cDNA 合成采用 QuantiFast SYBR Green PCR Kit (QIAGEN公司生產(chǎn))進行，經(jīng)反轉錄獲得的cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 瓊脂糖凝膠電泳及實時熒光定量

使用 primer premier 5.0 軟件進行引物設計,引物序列結果見表 1。以β-actin作為內參，以cDNA為模板進行 PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

2.4 qRT-PCR 的擴增

表1目的基因及內參基因引物序列

Table1 Objective gene and reference gene primer sequence

目的/基因Target/gene引物序列(5’-3’)Primer sequence退火溫度/℃Annealing temperatureMyoDβ-actinF:GACAGGGAGGAGGGGGTAGAGR:TGCTGTCTCAAAGGAGCAGAF:CGTTGACATCCGTAAAGACR:GGAGCCAGGGCAGTAA6060

qRT-PCR以β-actin為內參，采用 QuantiFast SYBR Green PCR Kit，QIAGEN 公司產(chǎn)品進行，實時熒光定量PCR儀對目的基因MyoD進行實時熒光定量PCR，檢測該基因在4個階段小鼠骨骼肌中的表達情況。qRT-PCR每組樣本3個生物學重復。運用擴增曲線CT值計算(計算公式為：2-△△ CT)。

2.5 石蠟組織切片的制作與HE染色

將心肌組織樣放入Bouins液固定防止分解，用梯度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水份。將已透明的組織塊置于已溶化的石蠟中，放入溶蠟箱保溫。浸蠟2.5 h后進行包埋。使用切片機上將組織快切成6 μm薄片。用二甲苯進行脫蠟，再經(jīng)由高到低梯度酒精，蒸餾水洗滌，進行蘇木精、伊紅染色，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明后用中性樹膠封片。

2.6 免疫組織化學染色

將已經(jīng)包埋的石蠟組織切片經(jīng)脫蠟、恒溫箱孵育、PBS沖洗、進行封閉(5%山羊血清)、恒溫箱孵育、滴加目的兔抗多克隆抗體(4 ℃過夜)、37 ℃ 復溫、PBS 緩沖溶液沖洗、滴加HRP-山羊抗兔二抗工作液、孵育、PBS 緩沖溶液沖洗、DAB顯色、PBS 緩沖溶液、蘇木素輕度復染等步驟，使用中性樹膠進行封片后在顯微鏡下觀察。

2.7 圖像及實驗數(shù)據(jù)分析

用Step one軟件收集實時熒光定量PCR的數(shù)值，并進行處理和分析；在光學顯微鏡下觀察HE染色以及免疫組織化學實驗的切片，運用P Controller軟件進行照片采集。

3 結果和分析

3.1 電泳結果及分析

對組織中MoyD基因進行PCR擴增，擴增后產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，其電泳結果如圖1所示，與Marker相比可以看出，產(chǎn)物條帶單一，且清晰，表明心肌組織中有MoyD基因表達。溫度為60 ℃擴增的第四泳道條帶最清晰，在后續(xù)的實時熒光定量PCR中，退火溫度的設置以此試驗結果為標準。

圖1 不同退火溫度下條帶的清晰度Fig.1 Definition of strips at different annealing temperature注：“M”Marker;“1”：MyoD基因57 ℃時擴增產(chǎn)物; “2”：MyoD基因58 ℃時擴增產(chǎn)物; “3”：MyoD基因59 ℃時擴增產(chǎn)物;“4”：MyoD基因60 ℃時擴增產(chǎn)物。Note:"1":MyoD gene amplification product at 57 ℃; "2":MyoD gene amplification product at 58 ℃; "3":MyoD gene amplification product at 59 ℃; "4":MyoD gene amplification product at 60 ℃.

3.2 實時熒光定量PCR結果

MyoD基因擴增動力學曲線圖表明退火溫度為60 ℃，30 s，延伸溫度為72 ℃，20 s, 40擴增反應循環(huán)為PCR擴增條件，不同發(fā)育階段MoyD基因模板開始起峰的時間有差異。溶解曲線波峰一致，表明引物特異性良好(圖2)。

圖2 實時熒光定量PCR結果Fig.2 Real-time fluorescence quantitative PCR results

對不同發(fā)育階段的小鼠進行實時熒光定量PCR結果顯示:MyoD基因在幼年鼠中mRNA的相對表達量為性成熟鼠的7.9倍，差異極顯著(P<0.01)，體成熟后表達量僅為性成熟鼠的0.3倍，差異顯著(P<0.05)，老年鼠為性成熟鼠的0.5倍，差異顯著(P<0.05)。結果表明，隨著成熟細胞的增多，相對表達量呈急劇下降趨勢，體成熟后表達量最低，老年鼠表達量會略有升高。表明MyoD基因可能與心肌的成熟發(fā)育相關(圖3)。

圖3 MyoD基因在不同時期小鼠心肌中的表達Fig.3 Expression of MyoD gene in myocardium of mice at different stages 注：“***≤0.001差異極顯著”。Note：“***”≤0.001The difference is extremely significant.

3.3 HE染色的結果

取小鼠心肌組織進行組織包埋，制作切片后進行HE染色,結果如圖4所示：A圖可見幼年鼠細胞核密集，可見較多中央核，心肌細胞呈短桿狀，由B、C圖可見性成熟鼠，體成熟鼠細胞呈束狀排列，心肌纖維中出現(xiàn)明暗相間的橫紋，很難見中央核，由D圖可見老年鼠心肌纖維排列紊亂，偶見中央核。

圖4 小鼠不同發(fā)育階段的HE染色結果Fig.4 HE staining results of different developmental stages in mice注：A.幼年組 B.性成熟組 C.體成熟組 D.老年組。Note:A. juvenile group B. sexual maturation group C.body maturation group D senile group.

3.4 免疫組織化學結果

對不同發(fā)育階段小鼠心肌MyoD進行免疫組化染色，結果如圖5所示，MyoD在不同發(fā)育階段小鼠的心肌組織免疫反應陽性物定位于心肌纖維細胞的胞核和胞質中，在幼年小鼠中表達量最高，性成熟、體成熟、老年鼠中MyoD表達量均低于幼年鼠。其中性成熟小鼠表達量高于體成熟小鼠和老年小鼠，體成熟小鼠表達量最低。陰性對照切片，以PBS代替一抗，未見特異性著色。

圖5 不同發(fā)育階段的小鼠的免疫組織化學結果Fig.5 Immunohistochemical results of different developmental stages in mice 注：A、a：幼年組陽性、陰性結果；B、b：性成熟組陽性、陰性結果；C、c：體成熟組陽性、陰性結果；D、d：老年組陽性、陰性結果。Note:A、a：positive and negative results in juvenile group；B、b：Positive and negative results in sexual maturation group；C、c：Positive and negative results of body maturation group；D、d:Positive and negative results in the elderly group.

4 討論

MyoD是一種在體內和體外表達于骨骼肌和某些肌肉細胞系中的核磷酸化蛋白，它通過一種與蛋白家族具有同源性的結構域來將成纖維細胞轉化為成肌細胞[7]。MyoD是一種骨骼肌特異性蛋白，也是肌發(fā)生的主調節(jié)基因，能夠誘導多種分化細胞類型的肌發(fā)生[4，8]。骨骼肌的形成需要MyoD，是檢測骨骼肌成肌細胞所必需的[9]。同時MyoD也是成肌細胞的啟動基因[10]，該基因家族與肌細胞的增值分化有著密切關系。本試驗探究MyoD在不同發(fā)育階段小鼠心肌的表達定位。結果顯示，MyoD在小鼠的不同發(fā)育階段心肌上均有表達，其中在幼年階段心肌上的表達最顯著，而在性成熟階段、體成熟階段的表達降低，老年階段表達稍有回升，且差異顯著，MyoD表達量與小鼠心肌細胞的發(fā)育具有相關性。

MyoD基因家族的結構較為清楚，在骨骼肌的發(fā)育過程中起著重要的作用[11],已將該基因運用于各類動物的研究中。Weintraub等人在神經(jīng)、脂肪、肝臟和成纖維細胞系中觀察到的肌肉特異性基因MyoD的表達[12]。與此一致的是，Weinberg探究斑馬魚MyoD基因的分離試驗中發(fā)現(xiàn)，在野生型胚胎中MyoD在早期的開始表達[13]，從中胚期延伸到梭形體形成前，軸向中胚層直接相鄰的細胞表達該基因。在體細胞的形成和成熟過程中，每個體細胞的特定區(qū)域都有表達。Michelson對于分離出在果蠅胚胎發(fā)育過程中MyoD基因表達的研究表明MyoD基因在肌肉早期發(fā)育中的重要作用,即MyoD在果蠅胚胎中的表達預示著肌肉的形成[14,15]，得出其編碼與脊椎動物肌源性調節(jié)基因家族的序列相似性。MyoD對于肌肉的形成有重要的作用，尤其是在胚胎發(fā)育早期。

Megeney等人通過研究MyoD基因對骨骼肌成肌細胞功能的影響，結果表明MyoD對于肌肉再生具有重要意義[16～18]。與我們研究結果一致的是MyoD突變使得肌細胞數(shù)量增加，這些肌細胞具有正常的體外分化潛能。損傷后，MyoD突變體再生能力嚴重降低[19,20]。這可能是造成小鼠心肌MyoD表達老年期稍有回升的原因。MyoD在不同發(fā)育階段小鼠心肌細胞的表達存在差異性，可以作為判斷肌細胞發(fā)育程度的一種指標，為進一步研究肌肉作用機制提供理論依據(jù)。

5 結論

本研究檢測了不同生長發(fā)育階段小鼠心肌MyoD的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在不同發(fā)育階段的小鼠心肌纖維細胞胞核和胞質中均有表達，幼年鼠表達量最高，性成熟鼠、體成熟鼠和老年鼠均低于幼年鼠，老年鼠表達量稍有回升，推測MyoD表達量變化與小鼠心肌細胞的發(fā)育具有相關性。