劉志紅，解慶，李周岐

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

沙棘(Hippophaerhamnoides)為廣泛分布于歐亞大陸的胡頹子科沙棘屬樹種，植株抗性較強(qiáng)，具有水土保持、防風(fēng)固沙和改善環(huán)境的作用，同時(shí)果實(shí)具有很高的食用和藥用價(jià)值，是一種集生態(tài)效益、經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益于一身、開發(fā)利用價(jià)值極高的植物。

目前沙棘植株再生研究多集中在種子和莖尖等器官和組織培養(yǎng)上[1～3]，對(duì)離體器官胚狀體的誘導(dǎo)研究較少。胚狀體開始狀態(tài)為一個(gè)完整植物的雛形，可通過(guò)根端或類似胚柄結(jié)構(gòu)從外植體或愈傷組織中取得營(yíng)養(yǎng)，容易從愈傷組織的表面脫離，在適宜條件下再生成完整植物[4]。徐虹和梁宗鎖將中國(guó)沙棘(H.rhamnoidessubsp.sinensis)種子培養(yǎng)得到實(shí)生苗的胚根、胚軸、子葉、莖尖作材料，接種在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)通過(guò)器官發(fā)生途徑分化出再生芽，并伴有極少量的胚狀體[3]。在前人研究的基礎(chǔ)上[5～13]，本文以中國(guó)沙棘和蒙古沙棘(H.rhamnoidessubsp.mongolica)為材料，探究不同基因型、基本培養(yǎng)基、激素種類及激素濃度對(duì)沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)和胚狀體誘導(dǎo)分化的影響，以期確立高效、穩(wěn)定的沙棘胚性細(xì)胞系，并為體胚發(fā)生體系的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國(guó)沙棘和蒙古沙棘種子，由試驗(yàn)單位提供。

1.2 方法

1.2.1 無(wú)菌材料的獲得

將中國(guó)沙棘種子用流水反復(fù)沖洗，在95%乙醇中浸泡20 min后，于超靜工作臺(tái)上置入0.1% HgC12溶液中滅菌10 min，用無(wú)菌水沖洗4～5次，消毒濾紙吸干表面水分后接種在培養(yǎng)基上(①1/4 MS(僅調(diào)整大量元素，以下同)、②1/2 MS、③1/2MS+IAA 0.1 mg·L-1、④1/2 MS+NAA 0.2 mg·L-1)，經(jīng)暗培養(yǎng)5 d后轉(zhuǎn)入如1.2.4所示的培養(yǎng)環(huán)境，誘導(dǎo)種子萌發(fā)生長(zhǎng)。10 d后統(tǒng)計(jì)萌芽率。

1.2.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

分別將培養(yǎng)20、25 d種子實(shí)生無(wú)菌籽苗的子葉(0.5 cm×0.5 cm)、下胚軸切段(長(zhǎng)1.0 cm)和胚根(長(zhǎng)1.0 cm)接種于1/2MS附加不同濃度配比的6-BA、NAA、IBA的培養(yǎng)基上。MS培養(yǎng)基不利于沙棘培養(yǎng)[1，3]，所以基本培養(yǎng)基選擇1/2 MS。25 d后觀察誘導(dǎo)情況。

選取在培養(yǎng)基②上培育20 d的中國(guó)沙棘和蒙古沙棘無(wú)菌材料，以子葉連帶子葉以下0.2 cm下胚軸為整體，用無(wú)菌的鋒利刀片切下后，分別接種到以基本培養(yǎng)基、6-BA、IBA(分別標(biāo)記為A、B、C)為變化因子構(gòu)成的L9(34)正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)配方上?；九囵B(yǎng)基選擇1/2 MS、1/3 MS、1/4 MS培養(yǎng)基，6-BA采用0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-13個(gè)水平，IBA采用2.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、1.0 mg·L-13個(gè)水平。每組18瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)。培養(yǎng)30 d統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率。參考劉志紅等[14]的分析方法，確定試驗(yàn)范圍內(nèi)最適合沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

1.2.3 胚狀體誘導(dǎo)分化

分別將由子葉、下胚軸、子葉連帶0.2 cm下胚軸獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加不同濃度IBA、KT、6-BA的1/3MS分化培養(yǎng)基上。每組18瓶，每瓶接種1個(gè)外植體，3次重復(fù)。30 d統(tǒng)計(jì)胚狀體誘導(dǎo)分化情況。

1.2.4 培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基

培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx。培養(yǎng)基pH為5.8，均附加蔗糖30 g·L-1，瓊脂6 g·L-1及各種激素。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)中國(guó)沙棘種子萌芽率的影響

中國(guó)沙棘種子接種5 d后，種子露白，均無(wú)感染，此時(shí)種皮易分泌大量酚類物質(zhì)使培養(yǎng)基褐化。將種子轉(zhuǎn)接一次，10 d后，不同培養(yǎng)基中種子萌發(fā)生長(zhǎng)差異顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)，培養(yǎng)基②中種子萌芽率達(dá)88.4%，培養(yǎng)基③④中種子萌芽率相對(duì)較低，胚根多畸形，可見激素對(duì)中國(guó)沙棘種子的萌發(fā)不利。因此，最適宜于中國(guó)沙棘種子萌發(fā)生長(zhǎng)的是未加任何激素的1/2 MS培養(yǎng)基，和劉麗等[2]沙棘種子萌發(fā)的基本培養(yǎng)基篩選結(jié)果相似。繼續(xù)培養(yǎng)5 d，即種子接種20 d(包括轉(zhuǎn)接一次)，可獲得誘導(dǎo)胚性愈傷組織的無(wú)菌外植體材料。

表1不同培養(yǎng)基及激素濃度對(duì)中國(guó)沙棘種子萌發(fā)生長(zhǎng)的影響

Table1 Seedlings growth situation on different culture medium

處理組合No.種子萌芽率/%Seed germina-tion rate籽苗生長(zhǎng)狀況Seedlings growth situation①75.0幼芽長(zhǎng)勢(shì)良好,根莖健壯②88.4幼芽長(zhǎng)勢(shì)良好,生長(zhǎng)快,根莖健壯③66.7根尖呈圓錐狀,膨大且多畸形,無(wú)根系發(fā)育④44.2須根少,主根細(xì)長(zhǎng)

2.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

不同外植體對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率差異明顯，如表2所示。

表2不同外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Table2 Effect on the induction of embryogenic callus basing different explant

苗齡/天Age處理組合No.因素/mg·L-1Factor誘導(dǎo)率/%Induction ratesNAAIBA6-BA子葉Cotyledon胚根Taproot胚軸HypocotylA0.5 90.9033.320B2.0000C0.030.510028.633.3A0.580.00025B2.0000C0.030.55000

種子培養(yǎng)20 d比培養(yǎng)25 d所得的無(wú)菌試驗(yàn)材料誘導(dǎo)率高。其中子葉為外植體，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較高，子葉是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳外植體。胚根、下胚軸的誘導(dǎo)率相對(duì)較低，甚至不能誘導(dǎo)得到愈傷組織。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，可誘導(dǎo)胚性愈傷組織的下胚軸大多取自近子葉端。激素組合B中均表現(xiàn)外植體明顯膨大，淡黃褐色，但無(wú)愈傷組織誘導(dǎo)，可能IBA濃度高于2.0 mg·L-1時(shí)，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生抑制。組合C中愈傷組織誘導(dǎo)率很高，但后期極易褐化死亡，可能與外源激素NAA的選擇有關(guān)。

表3 沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)的L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Induction of embryogenic callus basing L9(34) Orthogonal Design Test

注：W為誤差相；R1、R2為極差；K11、K12、K13和 K21、K22、K23分別為中國(guó)沙棘和蒙古沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)各影響因素水平1、水平2、水平3的均值。

Note：W shows error; R1, R2 shows xmax-xmin; K11, K12, K13 shows mean value of level1, level2, level3 forH.rhamnoidessubsp.sinensis; K21, K22, K23 shows mean value of level1, level2, level3 forH.rhamnoidessubsp.Mongolica.

為了進(jìn)一步研究不同基因型間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率是否存在差異和優(yōu)化胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，選擇基本培養(yǎng)基、6-BA、IBA為變化因子構(gòu)成的L9(34)正交設(shè)計(jì)培養(yǎng)配方(表3)。子葉和近子葉端的下胚軸均可見胚性愈傷組織的誘導(dǎo)(表2)，因此在優(yōu)化試驗(yàn)中選擇了子葉連帶0.2 cm下胚軸為外植體。

不同基因型間，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在差異，其中中國(guó)沙棘誘導(dǎo)率相對(duì)較高。由極差計(jì)算表明，各因素對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)起作用的順序?yàn)镃(IBA)>B(6-BA)>A(基本培養(yǎng)基)，細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素IBA濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著作用。基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)作用不明顯。各因素的最優(yōu)水平分別為A1、B1、C3，因此，篩選的胚性愈傷組織誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為1/3 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1。

2.3 胚狀體誘導(dǎo)分化

胚狀體發(fā)育過(guò)程與合子胚相似，發(fā)生的最早階段具有兩極性，即莖端(胚芽)和根端(胚根)。在適宜的培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)胚狀體分化發(fā)育，經(jīng)過(guò)原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚及子葉胚等幾個(gè)階段。子葉胚階段體積較大，較直觀。

由子葉、胚軸獲得的胚性愈傷組織難以繼續(xù)分化。由子葉連帶0.2 cm胚軸誘導(dǎo)的胚性愈傷組織則可見胚狀體的分化(表4)。IBA濃度為0.3 mg·L-1，可見子葉胚，但部分子葉胚出現(xiàn)脫分化現(xiàn)象；降低IBA濃度至0.05 mg·L-1，胚狀體分化且子葉胚生長(zhǎng)正常。低濃度的6-BA對(duì)胚狀體分化有一定的影響，每個(gè)外植體平均誘導(dǎo)分化個(gè)數(shù)隨其濃度的升高而增多，但分化率不隨其濃度變化而變化。培養(yǎng)基中添加KT，可增加每個(gè)外植體胚狀體誘導(dǎo)分化個(gè)數(shù)，也可以提高分化率。本試驗(yàn)篩選的胚狀體誘導(dǎo)分化最適培養(yǎng)基為1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。

將獲得的子葉胚轉(zhuǎn)接至1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基，繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。相對(duì)于直接由種子萌發(fā)所得實(shí)生籽苗，由胚狀體發(fā)育而成的幼苗子葉肥厚，胚軸粗短，胚根略粗。

表4 不同種類和濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)沙棘胚狀體誘導(dǎo)分化的影響Table 4 Effects of different hormones on the somatic embryogenesis induction

3 結(jié)論與討論

室內(nèi)非無(wú)菌環(huán)境誘導(dǎo)沙棘種子萌發(fā)所得外植體消毒極為困難，污染率高，且材料幼嫩，在消毒過(guò)程中易失去活性，這是獲得沙棘胚性愈傷組織試驗(yàn)材料的一大障礙。為了消除這一障礙，本試驗(yàn)直接在無(wú)菌條件下培養(yǎng)種子，采用無(wú)菌種子萌發(fā)所得的胚軸、胚根、子葉等為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)，極大的減少了污染。

在不添加激素的1/2 MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)中國(guó)沙棘種子萌發(fā)的萌芽率最高，且長(zhǎng)勢(shì)良好，種子培育20 d可獲得大量無(wú)菌試驗(yàn)材料。在添加激素的培養(yǎng)基上，中國(guó)沙棘種子雖然也能萌發(fā)，但多表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢或根系畸形。

試驗(yàn)范圍內(nèi)，1/3 MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1適合胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率可達(dá)75.9 %；胚狀體誘導(dǎo)分化的最佳培養(yǎng)基為1/3 MS+IBA 0.05 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1。在細(xì)胞的胚性化過(guò)程中，激素調(diào)控了植物細(xì)胞分化、生長(zhǎng)方向和進(jìn)程，但組織在離體培養(yǎng)條件下合成生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的能力較低，在培養(yǎng)基中添加適當(dāng)種類和濃度的植物激素是成功誘導(dǎo)胚性愈傷組織和胚狀體分化的重要因素[15～22]。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在基因型間的差異，其中中國(guó)沙棘誘導(dǎo)率相對(duì)較高。IBA對(duì)沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著作用，表明IBA是促進(jìn)外植體細(xì)胞分化形成胚性愈傷組織所必需的植物激素，6-BA只對(duì)中國(guó)沙棘胚性愈傷組織誘導(dǎo)具有顯著作用，可能與不同基因型間內(nèi)源激素的組成和水平有關(guān)。低濃度的IBA和6-BA對(duì)胚狀體分化有一定的影響。培養(yǎng)基中添加KT，可增加每個(gè)外植體胚狀體誘導(dǎo)分化個(gè)數(shù)，提高分化率，這可能與三者的合理配比所起協(xié)同作用有關(guān)，協(xié)同作用大小及機(jī)理有待于進(jìn)一步深入研究。通過(guò)胚胎發(fā)生途徑得到胚狀體的同時(shí)，仍可見通過(guò)器官發(fā)生途徑分化出的再生芽，僅誘導(dǎo)出現(xiàn)胚狀體的培養(yǎng)基(含激素配比)還需繼續(xù)試驗(yàn)分析。

以子葉連帶0.2 cm胚軸為材料可誘導(dǎo)胚狀體分化，而單獨(dú)的子葉或胚軸難以誘導(dǎo)胚狀體分化，我們推測(cè)近子葉端的下胚軸較易形成胚狀體，連帶的子葉為胚狀體生長(zhǎng)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)源激素的調(diào)控。