覃劍鋒，段龍飛，蔡陽光，郭邦利，陳國愛，劉次鵬

(陜西省安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 安康 725021)

魔芋屬天南星科 (Araceae) 魔芋屬 (AmorphophallusBlume)多年生草本植物，是一種富含葡甘聚糖且應(yīng)用價(jià)值較高的作物。主要分布在亞洲、非洲地區(qū)[1]，我國也是其原產(chǎn)國之一，多分布于南方各省山地丘陵區(qū)[2]。目前，魔芋育種工作相對(duì)滯后，缺少高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病的新品種[3]。雜交育種是培育魔芋新品種的有效途徑，但魔芋雌雄同株不同花造成的生殖隔離和魔芋種間花期相差較遠(yuǎn)造成的時(shí)間隔離一直是制約魔芋雜交育種工作的瓶頸[4]。近年來，已基本完成通過溫濕度調(diào)控魔芋花期以克服時(shí)間隔離的研究。但天然授粉成功率低、花粉材料浪費(fèi)嚴(yán)重，故采用人工輔助授粉顯得尤為必要。魔芋花粉包含本屬植物的各種基因類型，是種質(zhì)保存和交換的重要材料[5]?；ǚ勖劝l(fā)的情況直接決定了雜交育種工作的成敗，花粉萌發(fā)的情況通常受花粉本身活力、萌發(fā)條件等影響[6]。本試驗(yàn)以花魔芋花粉為研究材料，研究不同培養(yǎng)環(huán)境條件對(duì)其花粉萌發(fā)的影響，以期為魔芋雜交育種工作中的人工輔助授粉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為安康地區(qū)重要的栽培農(nóng)家品種嵐皋花魔芋 (A.konjac)，定植于安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所魔芋種質(zhì)資源圃。2017年5月8日下午5時(shí)切取第2天要散粉植株的雄花序，放在硫酸紙上，第2天收集散出的成熟花粉。

1.2 花粉培養(yǎng)法

采用離體培養(yǎng)法，選用0.7%瓊脂固體培養(yǎng)基。溶化后取5 mL液態(tài)培養(yǎng)基加入直徑90 mm培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固?；ǚ塾眠m量無菌水稀釋并充分混勻，滴管滴取花粉懸浮液于培養(yǎng)皿中，并用涂布器涂抹均勻。蓋好培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中(28 ± 0.2) ℃下暗培養(yǎng)。

選用Olympus CX-22，10×10倍顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)。以花粉管長度超過花粉粒直徑的一半以上作為花粉萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，用明美顯微數(shù)碼測(cè)量分析系統(tǒng)進(jìn)行花粉管長度測(cè)量。每個(gè)處理每次觀察隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)(注：每個(gè)視野花粉不少于30粒)，重復(fù)3次，計(jì)算平均萌發(fā)率。利用Excel和SPSS 19.0進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

花粉萌發(fā)率 /%=(萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù))× 100

1.3 試驗(yàn)處理

1.3.1 最適培養(yǎng)基篩選

以花魔芋花粉為供試材料，采用離體萌發(fā)法進(jìn)行最佳培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)[7]。設(shè)定最適培養(yǎng)基組分[8](蔗糖、硼酸、Ca(NO3)2、MgSO4、KNO3)及各組分含量，利用SPSS軟件設(shè)計(jì)5因子4水平的正交實(shí)驗(yàn)方案(表1)。以李勇軍報(bào)道的[9]魔芋花粉離體培養(yǎng)配方：蔗糖10%、硼酸200 mg·L-1、Ca(NO3)2300 mg·L-1、MgSO4200 mg·L-1、KNO3100 mg·L-1為對(duì)照。培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在28 ℃的環(huán)境下培養(yǎng)4 h后，檢測(cè)花粉的萌發(fā)率以及花粉管長度，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果確定最佳培養(yǎng)基組分，并利用相關(guān)矩陣分析不同培養(yǎng)基組分對(duì)花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響。

1.3.2 最適培養(yǎng)溫度篩選

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號(hào)5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)溫度(4、10、16、22、28、34、40 ℃)進(jìn)行培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)皿分別檢測(cè)花粉萌發(fā)率及花粉管長度。

1.3.3 最適培養(yǎng)時(shí)間測(cè)定

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號(hào)5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)定為28 ℃，培養(yǎng)基pH值設(shè)定為6.5，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間(0.5、2.0、4.0、12.0、24.0、48.0 h)進(jìn)行培養(yǎng)，在不同的培養(yǎng)時(shí)間取出培養(yǎng)皿分別統(tǒng)計(jì)當(dāng)前的花粉萌發(fā)率及花粉管長度。在統(tǒng)計(jì)過程中，隨著觀察時(shí)間的延長，已萌發(fā)的花魔芋花粉管逐漸出現(xiàn)破裂解離的現(xiàn)象，影響試驗(yàn)記錄的延續(xù)性。故在本試驗(yàn)中，前一時(shí)間段里已萌發(fā)或萌發(fā)且花粉管破裂解離的花粉細(xì)胞不計(jì)在當(dāng)前的花粉萌發(fā)數(shù)內(nèi)。

1.3.4 最適培養(yǎng)pH值測(cè)定

以花魔芋花粉為供試材料，基本培養(yǎng)基選用1.3.1中篩選出的最適培養(yǎng)基(表1編號(hào)5培養(yǎng)基)，培養(yǎng)環(huán)境溫度設(shè)定為28 ℃，在此基礎(chǔ)上設(shè)置培養(yǎng)pH值(4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)分別進(jìn)行培養(yǎng)，4 h后取出培養(yǎng)皿分別檢測(cè)花粉萌發(fā)率及花粉管長度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

結(jié)果表明：花魔芋花粉在16號(hào)培養(yǎng)基上萌發(fā)率最低，在1、5、6、9號(hào)和CK培養(yǎng)基上均能較好的萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)到19.00%以上(表1)。其中在5號(hào)培養(yǎng)基上花魔芋花粉萌發(fā)率最高為28.95%，CK次之，萌發(fā)率為26.24%。且5號(hào)和CK較其他幾種處理差異極顯著。從花粉管長度來看，在5號(hào)培養(yǎng)基上效果最佳，花粉管長度達(dá)到205.34 μm，與其他幾種處理差異極顯著。故5號(hào)培養(yǎng)基(組分為蔗糖10%、H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1)最適宜于做花魔芋花粉的萌發(fā)和花粉管生長研究。

由表2相關(guān)矩陣分析可見，不同培養(yǎng)基組分對(duì)花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響不同。對(duì)于花魔芋花粉萌發(fā)率而言，影響程度依次是硼酸濃度>蔗糖濃度>KNO3濃度>Ca(NO3)2濃度>MgSO4濃度。對(duì)于花魔芋花粉管長度而言，影響程度依次是硼酸濃度>KNO3濃度>Ca(NO3)2濃度>MgSO4濃度>蔗糖濃度。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)花魔芋花粉萌發(fā)率和花粉管長度的影響Table 1 Effect of different culture medium on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac.

注：表中各字母表示不同處理間在0.01極顯著水平上差異顯著，花粉萌發(fā)率之間的差異性用大寫字母表示，花粉管長度之間的差異性用小寫字母表示。

Note： The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.

表2 相關(guān)矩陣分析Table 2 Related Matrix analysis

2.2 溫度對(duì)花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

由圖1可見，花魔芋花粉的萌發(fā)率隨著培養(yǎng)溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)花粉萌發(fā)率為27.50%，達(dá)到最大值。溫度超過34 ℃，萌發(fā)率又迅速下降。28 ℃時(shí)的萌發(fā)率較 22 ℃和34 ℃而言差異不顯著，但較其他4個(gè)處理差異極顯著。在4 ℃和40 ℃時(shí)，花魔芋花粉萌發(fā)均較低，說明該溫度分別接近花魔芋花粉萌發(fā)的極限低溫和極限高溫。就花粉管長度而言，培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)達(dá)到最大值為251.78 μm，較其它溫度下的花粉管長度差異極顯著。溫度為4 ℃和40 ℃時(shí)，僅有零星花粉管生長，且平均長度分別為38.27 μm和 40.12 μm，僅為28 ℃時(shí)的15%左右。

試驗(yàn)表明：培養(yǎng)溫度過高或過低均不利于花魔芋花粉的萌發(fā)及花粉管的伸長?；в蠡ǚ蹆H在22～28 ℃范圍內(nèi)較好的萌發(fā)和生長，其中28 ℃是其離體培養(yǎng)的最適溫度。

圖1 不同溫度對(duì)花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac 注：圖中各字母表示不同處理間在0.01極顯著水平上差異顯著，花粉萌發(fā)率之間的差異性用大寫字母表示，花粉管長度之間的差異性用小寫字母表示。下同。 Note: The differences in germination rate of pollen were expressed in capital letters and in length of pollen tube in lowercase letters.The same below.

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

魔芋花粉接種后，在(28 ± 0.2) ℃條件下暗培養(yǎng)，定時(shí)測(cè)定當(dāng)前花粉的萌發(fā)率和花粉管長度。由圖2可見，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長花粉的即時(shí)萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。培養(yǎng)4 h時(shí)，花粉即時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最大值為27.20%，較其它幾種處理差異極顯著。隨著觀察時(shí)間的延長，花粉即時(shí)萌發(fā)率顯著降低。表明4 h時(shí)，花魔芋花粉集中萌發(fā)，為花魔芋花粉萌發(fā)率最佳觀察時(shí)間。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.2 Effect of different culture time on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花魔芋即時(shí)花粉管長度受不同培養(yǎng)時(shí)間影響，在培養(yǎng)0.5～4 h時(shí)間范圍內(nèi)，即時(shí)花粉管長度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增長。培養(yǎng)4 h時(shí)，即時(shí)花粉管長度達(dá)最大值，為263.36 μm。較其他時(shí)間段而言，差異極顯著。在培養(yǎng)4～24 h時(shí)間范圍內(nèi)，即時(shí)花粉管長度呈現(xiàn)急劇下降趨勢(shì)。在24～48 h內(nèi)，即時(shí)花粉管長度變化平緩?；谂囵B(yǎng)后即時(shí)花粉萌發(fā)率和即時(shí)花粉管長度的表現(xiàn)趨勢(shì)，故4 h為花魔芋花粉離體培養(yǎng)觀察統(tǒng)計(jì)的最適時(shí)間。

2.4 培養(yǎng)基pH值對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管伸長的影響

由圖3可見，花魔芋花粉萌發(fā)率隨著pH值的增大呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在培養(yǎng)基pH值6.0和6.5時(shí)花粉萌發(fā)率分別為17.09%和17.24%，與其它幾種處理相比，達(dá)到了極顯著差異水平。pH值4.0～6.0時(shí)花粉管長度沒有明顯變化，pH值6.5時(shí)，花粉管長度明顯上升，且達(dá)到最大值，為114.45 μm，較其它幾種處理差異極顯著。當(dāng)pH值高于6.5之后，花粉管長度隨著pH值的增大而降低。即花魔芋花粉萌發(fā)和花粉管伸長的最適pH值為6.5。

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于魔芋花粉保存及萌發(fā)的研究相對(duì)較少，張盛林等[10]、李勇軍等[9]研究表明真空干燥低溫保存能將魔芋花粉活力維持在一個(gè)來年可利用的范圍內(nèi)。張玉進(jìn)[11]等研究表明魔芋花粉經(jīng)液氮超低溫 (-196 ℃)保存后，較新鮮花粉有更高的離體萌發(fā)率。目前，花粉生活力評(píng)價(jià)主要方法有染色法、離體萌發(fā)法及授粉法等[6,7,12]。對(duì)魔芋而言，前期的研究主要通過萌發(fā)法來檢測(cè)貯藏魔芋花粉活力[9,11,13]，花粉萌發(fā)法測(cè)定花粉生活力的確最為直觀、準(zhǔn)確，但需在25～28 ℃培養(yǎng)3～4 h甚至更長時(shí)間，所以李勇軍等[14]通過魔芋花粉生活力檢測(cè)方法的比較研究得出了TTC染色法測(cè)定更適用于魔芋花粉活力的快速檢測(cè)，目前該方法在魔芋花粉活力的檢測(cè)中應(yīng)用極廣。

圖3 不同pH值對(duì)花魔芋花粉活萌發(fā)率和花粉管長度的影響Fig.3 Effect of different pH values on pollen germination rate and pollen tube length of Amorphophallus konjac

花粉內(nèi)壁以及營養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)膜在萌發(fā)孔處外突，形成花粉管的乳狀頂端的過程稱為花粉萌發(fā)[15]。有研究表明：硼是影響花粉萌發(fā)的重要因素之一[16,17]。離體培養(yǎng)時(shí)，在培養(yǎng)基中加入適量的硼和Ca2+有助于花粉的萌發(fā)[18,19]。這與本研究結(jié)果相一致。一般情況下，一定面積內(nèi)的人工培養(yǎng)基或柱頭上的花粉粒越多，其萌發(fā)率就越高，花粉管的生長也越好，這一現(xiàn)象被稱之為集體效應(yīng)。有學(xué)者推測(cè)花粉的集體效應(yīng)可能與花粉本身帶有激素和營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)花粉萌發(fā)和花粉管生長的作用不同。

李勇軍等[20]研究了不同培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)溫度對(duì)魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長的影響。其研究結(jié)果顯示，魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長的適宜蔗糖濃度為10%～ 15%，適宜培養(yǎng)溫度為26～28 ℃，適宜硼酸濃度為150～200 mg·L-1，適宜硝酸鈣濃度為200～300 mg·L-1。這與本研究篩選出的最適培養(yǎng)基配方：蔗糖10%、硼酸H3BO3100 mg·L-1、Ca(NO3)2200 mg·L-1、MgSO4300 mg·L-1、KNO3200 mg·L-1略有差異。本研究對(duì)離體培養(yǎng)基配方中的每一個(gè)組分及其用量均進(jìn)行了細(xì)致研究，從而篩選出最佳組合以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)中。前期研究證實(shí)一定濃度的硼酸和硝酸鈣可促進(jìn)魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長。硝酸鉀在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)魔芋花粉萌發(fā)和花粉管生長影響不顯著[20]。本研究通過不同營養(yǎng)組分與花粉萌發(fā)率及花粉管長度的相關(guān)性分析得出對(duì)于花魔芋花粉萌發(fā)率而言，影響程度最大的是硼酸濃度，而后依次是蔗糖濃度、KNO3濃度、Ca(NO3)2濃度、MgSO4濃度。對(duì)于花魔芋花粉管長度而言，影響程度最大的依然是硼酸濃度，而后依次是KNO3濃度、Ca(NO3)2濃度、MgSO4濃度和蔗糖濃度。

在本試驗(yàn)中，以最重要的魔芋栽培種花魔芋花粉為研究材料，具有很強(qiáng)的代表性。但是離體培養(yǎng)條件研究中，萌發(fā)率均不高。這一結(jié)果與李勇軍等[20]研究結(jié)果較為一致。推測(cè)花粉整體萌發(fā)率不高的原因在于：首先，新鮮采集的花粉本身的萌發(fā)率并不高，這可能與散粉時(shí)節(jié)的氣候條件有一定關(guān)系。再者，固體培養(yǎng)時(shí)如何將花粉均勻散布并保持恒定的培養(yǎng)基表面濕度，可能會(huì)影響花粉本身的萌發(fā)率。因此，培養(yǎng)方法的改進(jìn)很有必要。本研究的花粉管長度與李勇軍等[20]研究結(jié)果存在一定差異，推測(cè)主要是因?yàn)椴煌胤椒N魔芋花粉本身差異較大。