董福雙，劉永偉，呂孟雨，周 碩，楊 帆

(河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，石家莊 050051)

目前大多轉(zhuǎn)基因技術，都離不開組織培養(yǎng)，存在著受基因型限制、操作復雜、需借助抗性標記篩選、周期長、轉(zhuǎn)化效率低、轉(zhuǎn)化結果不穩(wěn)定等突出問題。為了避免以上問題，利用植物活體直接轉(zhuǎn)化也受到諸多研究者們關注，如花粉管道法、種子吸漲法、植物莖尖轉(zhuǎn)化法等[1]。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)芽生長點法是以植物莖尖為轉(zhuǎn)化受體的一種活體轉(zhuǎn)基因方法，可擺脫離體培養(yǎng)技術，適合于組織培養(yǎng)困難型的作物品種，已在向日葵[2]、棉花[3]，苜蓿[4]玉米[5]、水稻[6]、小麥等[7-8]作物中有轉(zhuǎn)化成功的報道，并且在一些作物中獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。但以往研究大多集中在轉(zhuǎn)化方法和轉(zhuǎn)化技術方面，至于轉(zhuǎn)化成功后對外源基因在遺傳后代的遺傳分析并未見報道。轉(zhuǎn)基因植株的后代遺傳分析鑒定，不僅是直接檢驗轉(zhuǎn)化效率、轉(zhuǎn)化技術和轉(zhuǎn)化條件的最有效手段，而且是研究外源基因在轉(zhuǎn)化后代中的整合、遺傳分離組合、表達規(guī)律等方面的基礎,更重要的是對轉(zhuǎn)化品系的實際應用價值的判定和將具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的其他外源基因的成功轉(zhuǎn)化，以及轉(zhuǎn)化后的整合、表達規(guī)律和應用提供理論和技術依據(jù)。

本試驗以“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)小麥芽生長點法”獲得的3個世代轉(zhuǎn)基因小麥后代為研究材料，通過對轉(zhuǎn)基因后代的檢測及遺傳規(guī)律的分析，探討外源基因在轉(zhuǎn)化后代中的遺傳分離規(guī)律，為其應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

利用“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)小麥芽生長點法”獲得的小麥品種‘金禾9123’‘石4185’‘周麥18’‘濟麥22’等轉(zhuǎn)基因小麥后代株系為試驗材料。編號為08D、10D的株系，轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒為pCAMBIA-2201含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt-Ⅱ)和β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)；其他轉(zhuǎn)基因株系轉(zhuǎn)化所用質(zhì)粒為pCAMBIA-3301含雙丙氨酰磷抗性基因(bar)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)。

1.2 方 法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因材料的獲得 利用“一種充分微創(chuàng)種子芽生長點的單子葉植物轉(zhuǎn)基因方法”(專利號：2012103003229)轉(zhuǎn)化小麥：用攝子掰去萌動1～2 d 小麥胚芽鞘和部分葉片暴露出生長點，利用農(nóng)桿菌侵染微創(chuàng)后的生長點進行活體轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的小麥按單株收獲T0種子，將T0種子萌發(fā)成苗進行抗性篩選及分子檢測，獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)抗性篩選及分子檢測為陽性的T1、T2、T3和T4代植株也按單株播種或收獲。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因后代的抗性篩選 將轉(zhuǎn)入新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt-Ⅱ) 的后代材料，進行抗卡那霉素篩選：75 mg·L-1卡那霉素溶液浸種36 h左右至發(fā)芽，擺放到用水浸濕的蛭石培養(yǎng)缽中，25 ℃下每天光照 14～16 h培養(yǎng), 7 d后統(tǒng)計結果中白化的為非抗性株[10]。

將轉(zhuǎn)入雙丙氨酰磷抗性基因(bar)的后代材料，進行抗除草劑(PPT)篩選：將種子胚向上擺放于蛭石中，于25 ℃、16 h/d光照條件下7 d左右，待苗長至兩葉一心后，將第1片葉正面用記號筆劃一橫線，在橫線處正反兩面涂抹100 mg/L的PPT溶液，于25 ℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計結果，以葉片保持綠色不變黃的為抗性植株，葉片黃化失綠的為非抗植株。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因后代的分子檢測 用2×CTAB法提取具有PPT抗性植株葉片的基因組DNA。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(npt-Ⅱ)的PCR檢測引物序列為：5′-CCACCATGATATTCGGCAAC-3′和5′-GTGGAGAGGCTATTCGGCTA-3′。雙丙氨酰磷抗性基因(bar)的PCR檢測引物為：P1:5′-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′和P2:5′-GTCTGCACCATCGTCAACC-3′；2種基因擴增片段長度為500 bp。反應體系為20 μL包含1 UTaq酶，2種引物為0.25 μmol/L，250 μmol/L的dNTP。程序為：95 ℃預變性3 min,95 ℃45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min 循環(huán)35次，72 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離并照像。取陽性植株PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠80 V穩(wěn)壓電泳1～2 h后，按分子克隆中的方法(molecular cloning)將DNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，以npt-Ⅱ/bar基因做探針與之進行雜交，按照Dig High prime DNA labeling and Detection Starter KitⅡ(羅氏公司)試劑盒進行。

2 結果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因后代材料的抗性篩選和分子檢測

將轉(zhuǎn)基因小麥后代材料，每個世代均按單株收獲，萌發(fā)種子成苗，經(jīng)過抗性篩選(圖1、圖2)和進一步的PCR檢測(圖3)來確認轉(zhuǎn)基因材料，并選擇部分陽性株進行PCR-Southern blot檢測，結果表明：經(jīng)過抗性篩選的95%的抗性苗PCR分子檢測為陽性，選擇部分PCR陽性株進行PCR-Southern blot檢測均為轉(zhuǎn)基因的植株(圖4)。

圖1 轉(zhuǎn)基因后代的卡那霉素篩選Fig.1 Kanamycin screening of transgenic plants

圖2 轉(zhuǎn)基因后代的除草劑篩選Fig.2 Herbicide screening of transgenic plants

2.2 轉(zhuǎn)基因小麥后代檢測結果與分析

通過對“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)小麥芽生長法”獲得的3個世代的轉(zhuǎn)基因小麥后代分析，結果表明小麥轉(zhuǎn)基因后代出現(xiàn)遺傳分離，轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因株分離比例在大多數(shù)轉(zhuǎn)基因后代株系中并不規(guī)律，一般出現(xiàn)3種遺傳分離情況:①轉(zhuǎn)基因后代外源基因完全丟失，檢測不到外源基因；②轉(zhuǎn)基因后代能夠檢測到外源基因，但轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因株分離比例分散，偏離孟德爾遺傳分離規(guī)律；③轉(zhuǎn)基因后代能夠檢測到外源基因，并且轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因株分離比例符合孟德爾遺傳規(guī)律。

利用“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)小麥芽生長點法”獲得的T1代轉(zhuǎn)基因小麥，為外源基因插入整合世代，不存在遺傳分離現(xiàn)象，因此T1代轉(zhuǎn)基因植株檢測是用來統(tǒng)計轉(zhuǎn)化率的，未做遺傳分離統(tǒng)計分析。

1～19.檢測樣品 Samples； 0.空白對照 Blank；CK-.陰性對照 Negative CK；CK+.陽性對照 Positive CK;M.DL 2000 marker

T2代33個株系的677個轉(zhuǎn)基因單株分析檢

CK.陽性對照 Positive CK；1.空白對照 Blank CK；2.陰性對照 Negative CK；3～11.檢測樣品 Samples

圖4PCR-Southern檢測
Fig.4PCR-Southernanalysisoftransformants

測的結果表明，轉(zhuǎn)基因株與非轉(zhuǎn)基因株分離比例在T2代中出現(xiàn)2種遺傳分離情況：20個株系(占總株系的61%)中檢測不到外源基因，外源基因完全丟失；其余13個株系(39%)中檢測到了外源基因，但轉(zhuǎn)基因株與非轉(zhuǎn)基因株分離比例偏離孟德爾遺傳分離規(guī)律(表1)。

T3代42個株系的922單株檢測分析結果表明，轉(zhuǎn)基因株與非轉(zhuǎn)基因株分離比例在T3代轉(zhuǎn)基因后代出現(xiàn)3種遺傳分離情況：①有22個株系(55%)檢測不到外源基因，屬于完全丟失；②有19個株系(43%)能檢測到外源基因，但轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因株分離比例復雜；③有1個株系(2%)轉(zhuǎn)基因株和非轉(zhuǎn)基因株分離比例符合孟德爾分離(表2)。

表1 T2代檢測到外源基因株系的分離情況Table 1 Statistical table of transgenic T2 generation

T4代8個株系的160單株檢測分析結果表明，T4代株系的轉(zhuǎn)基因株與非轉(zhuǎn)基因株分離比例出現(xiàn)3種遺傳分離情況①檢測不到外源基因，屬于完全丟失占25%；在能檢測到外源基因但分離比例復雜的占50%，符合孟德爾分離定律占25%(表3)。

表2 T3代檢測到外源基因株系的分離情況Table 2 Statistical table of analysis of the transgenic T3 generation

注：“*”,χ2測驗分離比率符合孟德爾遺傳分離比例,下同。

Note: “ *”,χ2test separation ratio meets Mengdeer genetic separation ratio，the same below.

表3 T4代小麥轉(zhuǎn)基因植株的檢測結果Table 3 Statistical table of the transgenic T4 generation

3 討 論

采用“農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化微創(chuàng)小麥芽生長點法”獲得轉(zhuǎn)基因小麥后代，外源基因遺傳表現(xiàn)不穩(wěn)定，其株系之間遺傳分離比例呈現(xiàn)多樣性，并存在大量外源基因丟失情況，隨著世代的增加，外源基因遺傳穩(wěn)定性有升高的趨勢。此結果與馬盾等[10]報到的花粉管道法獲得的轉(zhuǎn)基因后代外源DNA遺傳表現(xiàn)不穩(wěn)定，遺傳分離呈多樣性的結論相似。而通過傳統(tǒng)方法(轉(zhuǎn)化技術中包括組織培養(yǎng)過程)獲得的轉(zhuǎn)基因后代多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律[11-15]。分析其原因可能如下：通過組織培養(yǎng)的方法獲得的轉(zhuǎn)基因植物，其中抗性篩選參與在愈傷組織誘導、不定芽分化、不定根形成等無性繁殖過程中，將未轉(zhuǎn)化或外源基因插入表達不穩(wěn)定的細胞淘汰掉，留下表達穩(wěn)定的細胞分化成植株，因此利用此途徑獲得轉(zhuǎn)基因后代更容易穩(wěn)定遺傳。而利用芽生長點等活體轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)化技術中沒有抗性篩選無性繁殖培養(yǎng)的過程，那些插入不穩(wěn)定的外源基因容易被保留下來，而在再一次的有性繁殖過程中更容易丟失，所以轉(zhuǎn)基因后代T2代丟失嚴重，隨著世代的增加外源基因遺傳穩(wěn)定性有升高，也是必然趨勢。因此在活體轉(zhuǎn)化技術體系中如何提高轉(zhuǎn)基因后代的遺傳穩(wěn)定性是改進轉(zhuǎn)化技術體系的關鍵因素之一。