董德武，劉 宇，盧存龍，王麗雪，劉愛民

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重要生物資源保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽蕪湖 241000)

藍(lán)莓(Blueberry)是多年生灌木小漿果果樹，因果實(shí)呈藍(lán)色而得名[1]。藍(lán)莓果實(shí)中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和活性因子，具有防止腦神經(jīng)老化、強(qiáng)心、抗癌、軟化血管、增強(qiáng)人機(jī)體免疫、活化視網(wǎng)膜功效、強(qiáng)化視力、防止眼球疲勞等功能。中國(guó)藍(lán)莓種植面積和產(chǎn)量以年均 50% 的速度遞增[2]，2013年藍(lán)莓產(chǎn)量達(dá)到15 130 t[3]。同時(shí)，中國(guó)學(xué)者對(duì)藍(lán)莓的研究也逐年增多，劉鳳紅[4]研究藍(lán)莓根系內(nèi)生真菌的多樣性，龔娜等[5]研究不同菌根真菌對(duì)藍(lán)莓根際土壤微生物數(shù)量的影響。但是對(duì)于藍(lán)莓根際微生物的研究鮮有報(bào)道。

根際是一個(gè)由根系分泌物輸入高能量而導(dǎo)致微生物劇烈活動(dòng)的微生態(tài)系統(tǒng)[6]。根際土壤微生物可以影響土壤營(yíng)養(yǎng)的分解、轉(zhuǎn)化和植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收利用，同時(shí)也是衡量土壤肥力和養(yǎng)分的重要指標(biāo)[7-9]。根際微生物可促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，增加根系的吸收面積，間接改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況[10]。研究植物根際土壤微生物的方法主要包括傳統(tǒng)的微生物純平板培養(yǎng)法、基于細(xì)胞膜化學(xué)成分的細(xì)胞分析技術(shù)、現(xiàn)代分子生物學(xué)方法、基于碳源利用模式的Biolog微平板分析方法。其中，現(xiàn)代分子生物學(xué)方法又包括群落水平總DNA分析方法、核酸雜交技術(shù)、克隆文庫(kù)方法和基因指紋技術(shù)。在諸多方法中，平板計(jì)數(shù)方法只能得到微生物總量的1%[11]，微生物的群落信息量很少，不可避免地會(huì)造成特殊菌種的缺失及微生物原有群落結(jié)構(gòu)的改變，不能客觀地反映微生物的多樣性[12]。核酸技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，但也存在信息大量丟失的不足，如土壤細(xì)菌難以裂解引起DNA提取差異，PCR過程中也容易丟失許多信息[13-15]。PLFA(Phospholipid Fatty Acid)技術(shù)利用活體細(xì)胞細(xì)胞膜中含有的大量磷脂脂肪酸(PLFAs)，細(xì)胞中磷脂的組成與環(huán)境樣品中微生物的組成和生物量存在相對(duì)恒定的關(guān)系，不同類型的微生物通過不同的生化代謝途徑形成具有生物特異性的PLFA組成。通過分析PLFA圖譜推測(cè)細(xì)菌、真菌和放線菌的組成關(guān)系[16-17]，在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中較為常用。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與處理

安徽省蕪湖市南陵縣年平均氣溫15.8 ℃，冬、春兩季都在3.5 ℃以下。年平均日照時(shí)數(shù)1 935.4 h，占全年可照時(shí)數(shù)的43.7%。年平均降水量為1 402.6 mm，主要集中在4-6月，冬季較少。

莓嶺巴爾頓藍(lán)莓種植區(qū)土壤以紅色酸性土為主。利用取樣器隨機(jī)采集藍(lán)莓根基根際土壤迅速裝入塑料袋內(nèi)，分為2份，一份自然風(fēng)干、過100目篩，用于測(cè)定土壤的理化性質(zhì)，另一份用于測(cè)定土壤微生物的脂肪酸。

1.2 方 法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)分析 凱氏定氮法測(cè)定總氮； NH4F-HCl法測(cè)定有效磷[18]；醋酸銨-火焰光度計(jì)測(cè)定速效鉀[18]；水合熱法測(cè)定有機(jī)質(zhì)。

1.2.2 土壤微生物總脂肪酸的提取 取10 g土壤樣品加入20 mL KOH-甲醇溶液，37 ℃水浴震蕩2 h (震蕩頻率130次·min-1)，再加入3 mL1.0 mol·L-1的乙酸，旋轉(zhuǎn)震蕩(震蕩頻率500次·min-1，時(shí)間30 s)后，加入10 mL正己烷，同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)50 μL，震蕩，37 ℃旋轉(zhuǎn)震蕩搖勻30 min后，4 000 r·min-1離心10 min，取5 mL上清置于離心管中，氮?dú)獯蹈伞Ｏ螂x心管中加入1 mL 體積比1∶1的正己烷-甲基叔丁基醚溶液，充分溶解2 h，轉(zhuǎn)入GC小瓶，用于脂肪酸分析[19-20]。所有使用的試驗(yàn)器材都用色譜級(jí)的甲醇45 ℃浸泡過夜，再用超純水清洗，烘干。C19∶0內(nèi)標(biāo)配制：稱取0.1 g C19∶0樣品溶于1 000 mL正己烷中，配成0.1 mg·L-1的溶液。0.2 mol·L-1的KOH-甲醇溶液：參照國(guó)標(biāo)(GB-601-2008)中0.1 mol·L-1KOH-乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。

1.2.3 脂肪酸的測(cè)定 采用島津GC/MS2010 PLUS測(cè)定，分析柱類型為RTX(30.0 m×0.25 mm×0.25 μm)。取1 μL待測(cè)樣進(jìn)行分析。GC測(cè)定條件：以氦氣為載體，柱內(nèi)流量為2 mL·min-1，總流量為40.2 mL·min-1。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，分流比為30∶1，柱溫箱程序升溫至40 ℃起始，保持2 min，以15 ℃·min-1升至170 ℃，保持2 min，再以1.5 ℃·min-1升至200 ℃，保持3 min，再以2 ℃·min-1升至225 ℃，保持3 min，以1.5 ℃·min-1升至250 ℃，保持2 min。MS條件：離子原溫度 250 ℃，溶劑切割時(shí)間為6 min，采用Scan掃描方式。

1.2.4 脂肪酸的命名方法 脂肪酸常用的命名格式為：X∶YWZ(a/i)，其中，X表示總碳數(shù)，Y表示雙鍵數(shù)，W表示甲基末端，Z表示距離甲基端的距離，表1中a和i分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)，10 Me表示在距分子末端第10個(gè)碳原子上有一個(gè)甲基，環(huán)丙烷脂肪酸用cy表示[21]。不同的磷脂脂肪酸代表特定的微生物[22-31]。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法 測(cè)定數(shù)據(jù)的方差分析、數(shù)據(jù)差異性分析、相關(guān)性分析利用SPASS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件、Origin8.0繪圖軟件、Excel2010軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

表1 表征微生物的PLFATable 1 Characterization of microbial PLFA

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓不同栽培年限根際土壤的理化性質(zhì)

如表2所示，不同栽培年限的藍(lán)莓根際土壤理化指標(biāo)差異明顯，且有效磷變化最大，其中6 a藍(lán)莓根際土壤中有機(jī)質(zhì)、有效磷、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高。不同栽培年限藍(lán)莓的土壤理化性質(zhì)不同，藍(lán)莓植株吸收土壤中各成分的能力也不同。藍(lán)莓植株的不同栽培年限與土壤養(yǎng)分因子的相關(guān)系數(shù)存在差異。隨著栽培年限的增大，藍(lán)莓根際土壤中速效鉀和有效磷顯著下降，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，而栽培年限與有機(jī)質(zhì)、全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相關(guān)性小。土壤養(yǎng)分因子間的相關(guān)性有差異，其中，有機(jī)質(zhì)與速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)高度負(fù)相關(guān)，而有機(jī)質(zhì)與全氮呈顯著正相關(guān)。相對(duì)非栽培區(qū)土壤理化性質(zhì)，栽培區(qū)土壤理化指標(biāo)變化顯著，特別是栽培年限越長(zhǎng)，土壤中速效鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)越小，表明藍(lán)莓生長(zhǎng)需要大量的速效鉀。

表2 不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤的理化指標(biāo)Table 2 The physical and chemical properties of rhizosphere soil in different cultivating year of blueberries

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.01)。

Note：In each column, means followed by different lowercase letters are significantly different(P≤0.01).

表3 不同栽培年限藍(lán)莓土壤微生物磷脂脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 3 Mass fraction of PLFA biomarkers in rhizosphere soil of blueberries under different cultivating year ng·g-1

注:- 未檢到。

Note：-Undetected.

2.2 不同栽培年限藍(lán)莓土壤微生物群落 PLFA 標(biāo)記分析

由表3可知，不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤中共檢測(cè)到21種PLFA，其中，細(xì)菌15種，真菌3種，放線菌2種。從圖1可以看出，在不同栽培年限的藍(lán)莓土壤中，占比最高的PLFA為16∶0和18∶1w9，皆占總量的37%以上。不同微生物類群的 PLFA在不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤中存在顯著或極顯著差異，并且呈不同的變化趨勢(shì)。隨著栽培年限增加，物種豐富度降低，但種類變化不明顯，與栽培5 a的植株相比，栽培6 a的植株缺少16∶1w9細(xì)菌類型，栽培9 a的植株缺少a15∶0和16∶1w9細(xì)菌。

圖1 不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤微生物種類差別Fig.1 Microorganism differences in rhizosphere soil of blueberries cultivated for different years

由圖2可知，除微生物種類有變化外，微生物總量也隨栽培年限的增加而逐漸降低：5 a>6 a>9 a。其中，放線菌總量隨栽培年限的增加而增加，呈完全直線性相關(guān)。與細(xì)菌、真菌相比，放線菌在各個(gè)樣本中相對(duì)較少，且栽培年限與細(xì)菌、真菌總量呈高度負(fù)相關(guān)，說(shuō)明藍(lán)莓根際微生物群落主要由細(xì)菌和真菌構(gòu)成。與非栽培區(qū)土壤微生物相比，栽培區(qū)根際土壤中微生物的類型和總量都高，說(shuō)明根際微生物對(duì)藍(lán)莓生長(zhǎng)具有重要的影響。

如圖3所示，各類群的PLFA 在不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤中存在差異，且種類和比例皆不相同。其中15∶0、i16∶0、16∶0、18∶2w6,9、18∶1w9、18∶0占生物總量的76.68%～73.02%。16∶0的豐富度最高，在各個(gè)樣品中占20.49%～27.49%，18∶1w9占16.38%～24.32%，18∶2w6,9占11.23%～17.56%，說(shuō)明這3個(gè)類型是藍(lán)莓根際微生物的主要類群。

圖2 不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤不同微生物類群PLFA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(左)和所占比例(右)Fig.2 PLFA mass fraction(left) and proportion(right) of different microbial groups in rhizosphere soil of blueberries under different cultivating year

樣品中微生物菌群具有相似性，主要優(yōu)勢(shì)群體在不同栽培年限的藍(lán)莓根際土壤中普遍存在，隨栽培年限的增長(zhǎng)，部分類群含量發(fā)生變化，但構(gòu)成沒有明顯差異，說(shuō)明在不同栽培年限中，根際優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)成具有穩(wěn)定性。相對(duì)非栽培區(qū)土壤，藍(lán)莓根際多4個(gè)類群，為a17∶0、i17∶1w5、7cy17∶0、9cy19∶0。因此，推測(cè)這 4 個(gè)類群可能是與藍(lán)莓生長(zhǎng)有關(guān)的根際微生物，占生物總量的5.18%～6.57%，且隨著栽培年限的增加有上升趨勢(shì)，呈高度相關(guān)性，聯(lián)合a15∶0和16∶1w9可作為藍(lán)莓栽培年限的推測(cè)。

2.3 不同栽培年限藍(lán)莓根際微生物磷脂脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與養(yǎng)分因子間的相關(guān)性分析

土壤養(yǎng)分相關(guān)因子與不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤微生物總量、細(xì)菌、放線菌和真菌的PLFA 的相關(guān)系數(shù)存在差異。如表4所示，細(xì)菌總 PLFA 與有機(jī)質(zhì)、全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀呈極顯著正相關(guān)；放線菌總 PLFA 與速效鉀和有效磷呈顯著負(fù)相關(guān)，而與全氮有弱相關(guān)性；真菌總 PLFA 與有機(jī)質(zhì)、全氮呈極顯著負(fù)相關(guān)；微生物總量與土壤速效鉀有顯著相關(guān)性。

圖3 不同栽培年限藍(lán)莓根際土壤微生物磷脂脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(左)及所占比例(右)Fig.3 Mass fraction (left)and proportion (right)of phospholipid fatty acid biomarkers(PLFA) of microorganism in rhizosphere soil in different cultivated years of blueberries

項(xiàng)目 Item有機(jī)質(zhì)Organic matter速效鉀Rapidly available potassium有效磷Available phosphorus全氮Total nitrogen真菌 Fungus0.969-0.7460.4420.977放線菌 Actinomyces0.321-0.772-0.8720.157細(xì)菌 Bacteria-0.9540.9850.118-0.892微生物總量 Microorganism amount-0.5640.8820.706-0.417

3 討 論

土壤微生物是土壤中活的有機(jī)體，是最活躍的土壤肥力因子之一。細(xì)菌、放線菌、真菌是構(gòu)成土壤微生物的主要生物量，其組成和數(shù)量變化反映土壤生物活性水平。根際作為根系、土壤界面的一個(gè)微環(huán)境，是土壤-根系-微生物三者緊密結(jié)合且相互影響的場(chǎng)所，是物質(zhì)轉(zhuǎn)化的活躍區(qū)域[5]。通過改善根際微生態(tài)環(huán)境來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)、提高植物抗性等方面的研究正日益受到人們的重視。根際中的有益微生物在增加土壤肥力、改善根際環(huán)境、促進(jìn)根系生長(zhǎng)和防治植物病害等方面均有積極的促進(jìn)作用。根際內(nèi)生真菌與藍(lán)莓根系互利共生，從而影響藍(lán)莓的生長(zhǎng)，劉鳳紅[4]研究表明，不同品種藍(lán)莓根系內(nèi)生真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)存在一定差異，各菌屬在不同栽培品種藍(lán)莓根系內(nèi)的優(yōu)勢(shì)度不同，不同栽培品種藍(lán)莓根系內(nèi)生真菌區(qū)系結(jié)構(gòu)也不同，同一栽培品種在不同栽培地區(qū)其根系內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)度、群落組成和結(jié)構(gòu)也存在一定差異。龔娜等[5]研究表明，不同菌根真菌影響藍(lán)莓根際微生物的數(shù)量和多樣性，通過改善根際微生態(tài)環(huán)境來(lái)改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況和促進(jìn)植物生長(zhǎng)。目前，土壤中大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)，本試驗(yàn)采用PLFA技術(shù)測(cè)定活體微生物細(xì)胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFAs)，通過分析PLFAs圖譜推測(cè)細(xì)菌、真菌和放線菌的組成關(guān)系。

在不同栽培年限的藍(lán)莓根際中，真菌/細(xì)菌：6 a>9 a>5 a，其與有機(jī)質(zhì)呈高度相關(guān)。根際微生物隨根齡變化顯著，但也有部分種屬在各根齡相同，如i17∶1w5為黃桿菌屬，不同根齡中始終保持在0.5～0.58。黃桿菌屬的占比與環(huán)境狀況密切相關(guān)，推斷此藍(lán)莓栽種過程中，土壤較少受到Cd和烴類等物質(zhì)的污染。假單胞菌(18∶1w7)能夠改善植物營(yíng)養(yǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，同時(shí)假單胞菌還能對(duì)土壤中的有毒物質(zhì)進(jìn)行降解[32-34]，可作為一種理想的植物微生態(tài)制劑生產(chǎn)菌種進(jìn)行開發(fā)。通過與土壤的理化指標(biāo)相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)假單胞菌質(zhì)量分?jǐn)?shù)與全氮、有效磷、有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)，可以通過施加全氮、有效磷和有機(jī)質(zhì)等來(lái)提高假單胞菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而改善藍(lán)莓根際的生長(zhǎng)環(huán)境。腐生真菌可以分解有機(jī)質(zhì)、改善土壤和提高植物的抗病性和抗逆性[35-37]，同時(shí)為其他生物提供硫、磷、鉀、鈣、鐵等礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素[39-40]，降解某些有毒物質(zhì)，保護(hù)環(huán)境[41]。分析AM真菌[37-38]、腐生真菌與土壤的理化指標(biāo)，AM真菌和腐生真菌總量與有效磷具有高度相關(guān)性，從而可以通過增加土壤有效磷改變AM真菌和腐生真菌的量，改善藍(lán)莓根系生長(zhǎng)環(huán)境，提高藍(lán)莓產(chǎn)量。

通過各微生物類群和土壤理化指標(biāo)分析可知，藍(lán)莓根際微生物生長(zhǎng)需要有效磷和速效鉀，特別是腐生真菌、AM真菌、18∶1w7等對(duì)植物生長(zhǎng)有益的微生物。在藍(lán)莓栽培和種植過程中，可以通過提高磷肥和鉀肥的施加量來(lái)增加土壤中速效鉀和速效磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有利于改善土壤有益微生物的生存環(huán)境，從而改善藍(lán)莓根際的生長(zhǎng)環(huán)境，進(jìn)一步提高藍(lán)莓的品質(zhì)和產(chǎn)量。