陳 磊，倪文浩，李雯雯，李欣毅，李文蓉

(1.新疆畜牧科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部草食家畜繁育生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第二中學(xué)，烏魯木齊 830000)

中國美利奴羊是中國于 1985 年育成的第一個(gè)毛用細(xì)毛綿羊品種，具有毛叢密度高、羊毛細(xì)長而彎曲和凈毛量高的特點(diǎn)。目前，羊毛纖維產(chǎn)量已經(jīng)占世界纖維原料的 1.9%[1]，是細(xì)毛羊主要的高附加值產(chǎn)品，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。中國雖是世界羊毛的生產(chǎn)大國，但優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊的羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)仍遠(yuǎn)落后于養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)國家，主要原因是細(xì)毛羊優(yōu)良品種選育擴(kuò)繁和羊毛質(zhì)量控制體系滯后。傳統(tǒng)的綿羊育種方法雖然能夠改良和提升羊毛產(chǎn)量和品質(zhì)，但周期長、進(jìn)展緩慢，而運(yùn)用分子育種技術(shù)在篩選獲得與細(xì)毛羊毛囊發(fā)育相關(guān)功能基因的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡明其對綿羊毛囊發(fā)育和毛品質(zhì)形成的影響，對推動細(xì)毛羊品種選育和提高中國優(yōu)質(zhì)細(xì)毛羊羊毛品質(zhì)具有重要意義。

可變剪接(或選擇性剪接， Alternative splicing)是指基因的 mRNA 前體通過不同的剪接方式(選擇不同的剪接位點(diǎn))拼接產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體，是生物體內(nèi)一種普遍存在的調(diào)控方式[2-3]。同時(shí)，可變剪接是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制?？勺兗艚佣喟l(fā)生在受體、信號傳導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子等參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和表達(dá)調(diào)節(jié)的基因上，對個(gè)體分化發(fā)育、凋亡和細(xì)胞興奮等生理過程的精確調(diào)控發(fā)揮重要作用[4-6]。此外，它也是導(dǎo)致真核生物基因和蛋白質(zhì)數(shù)量較大差異的重要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，基因可變剪接發(fā)生在動物神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肌肉和毛囊的生長發(fā)育過程中均具有關(guān)鍵的生物學(xué)功能[7-11]。

TGFβ2是TGF-β超家族成員之一，在毛囊形態(tài)發(fā)生、發(fā)育和毛囊周期性調(diào)控中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。Chuong等[12]研究發(fā)現(xiàn) TGFβ2 在毛囊基板和凝集簇中表達(dá)，能夠誘導(dǎo)胚胎間充質(zhì)中真皮凝集簇的形成，Soma等[13-14]研究發(fā)現(xiàn) TGFβ2 能夠抑制毛囊毛干的延長，誘導(dǎo)毛囊發(fā)生退行期的形態(tài)學(xué)改變，同時(shí)，免疫組化分析發(fā)現(xiàn) TGFβ2 在毛囊真皮乳頭、外根鞘、毛球和毛母質(zhì)細(xì)胞中均表達(dá)，且在毛囊生長期—退行期過渡階段， TGFβ2 在毛球內(nèi)的表達(dá)具有特異性，調(diào)控毛囊發(fā)育和毛囊周期性生長過程[15-17]。此外， TGFβ2 基因敲除小鼠模型發(fā)現(xiàn)，單拷貝失活的小鼠毛囊數(shù)量下降，而 TGFβ2 雙敲除小鼠毛囊的形成和生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響[18]。由此可見， TGFβ2 在調(diào)控動物毛囊生長發(fā)育和周期性循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用，但目前綿羊 TGFβ2 基因序列結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性尚不清楚，該基因在調(diào)控毛囊發(fā)生和發(fā)育中的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究對綿羊 TGFβ2 其剪切體CDS進(jìn)行克隆，利用生物信息學(xué)軟件對TGFβ2及其剪切體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，闡明其生物學(xué)特征，為深入研究 TGFβ2 在綿羊毛囊生長發(fā)育過程中的作用及其表達(dá)調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

綿羊?yàn)樾陆竽量茖W(xué)院綿羊中心羊場的2～3 歲中國美利奴羊，通過同期發(fā)情和人工授精技術(shù)分別采集中國美利奴羊妊娠期毛囊發(fā)育起始階段[第 55 天(D55)]、初級毛囊形成階段[第 75 天(D75)]、次級毛囊形成階段[第85天(D85)]、次級獲得性毛囊形成階段[第 105 天(D105)]和毛發(fā)生長成熟階段[第135 天(D135)]各 3 只胎羊體側(cè)皮膚組織樣本，分別置于凍存管中，保存在液氮中，備用。隨機(jī)挑選妊娠期第 85 天的 3 只中國美利奴羊體側(cè)皮膚組織樣本為模板，進(jìn)行綿羊 TGFβ2基因克隆。

1.2 主要試劑

Trizol試劑，Zero Blunt○RTOPO○RPCR cloning kit購自Life Technology公司；PrimeSTAR○RHS DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶購自TAKARA公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，感受態(tài)細(xì)胞DH5α，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒購自全式金科技有限公司；其他試劑為分析純產(chǎn)品。

1.3 皮膚組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物合成

參照TRIzol Reagent操作步驟分別提取中國美利奴羊體側(cè)皮膚組織總RNA，10 g/L非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用Nandrop 2000 核酸蛋白分析儀測定RNA的質(zhì)量濃度，按照反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成。

1.4 克隆引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中的綿羊 TGFβ2基因序列(XM_004013602)設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-GTCCGGATCCATGCACTACTGTGTGTTGA- GCG -3′(下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物：5′- CCTGAAGCTTTTAGCTGCATTTGCAAGACTTGAC-3′(下劃線為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn))，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.5 綿羊 TGFβ2 基因克隆

將 3 只中國美利奴羊皮膚組織總 RNA 等量混合，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA 為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系：cDNA模板 1.0 μL，Premix PrimeSTAR○RHS聚合酶25.0 μL，上、下游引物(10 mol/mL)各1.0 μL，滅菌去離子水 22.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 1.0 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后取 6.0 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。利用 DNA 膠回收試劑盒純化回收PCR 產(chǎn)物，隨后對 PCR 回收產(chǎn)物和 PCRTMBlunt Ⅱ-TOP○R克隆載體進(jìn)行雙酶切，利用 T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 DH5α 中，將細(xì)胞懸液涂于含有卡那霉素的 LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 16 h。挑取培養(yǎng)皿上的單克隆接種于含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒小型提取試劑盒提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定的陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.6 生物信息學(xué)分析

使用DNAstar軟件進(jìn)行克隆序列的拼接和各物種同源性分析；利用ProtParam(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)分析綿羊TGFβ2氨基酸的理化性質(zhì)[19]；利用TMHMM server 2.0 預(yù)測綿羊TGFβ2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域[20]；利用SignalP 4.0 軟件預(yù)測綿羊TGFβ2蛋白的信號肽；利用在線軟件Protcale(http://web.expasy.org/protscale/)進(jìn)行綿羊TGFβ2蛋白親水性/疏水性分析；利用NetPhos分析蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；利用NetNGlyc分析蛋白質(zhì)糖基化位點(diǎn)；使用Mega 6.0 軟件構(gòu)建 8 個(gè)物種TGFβ2的系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用PSORT II Prediction預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用SOPMA軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測綿羊TGFβ2蛋白的二級結(jié)構(gòu)；采用Phyre 2.0 軟件http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進(jìn)行綿羊TGFβ2蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊 TGFβ2 基因CDS的PCR擴(kuò)增

利用Trizol提取3只中國美利奴羊總RNA，非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測得到28 S、18 S和5 S 3條帶(圖略)，Nandrop分光光度計(jì)檢測吸光度OD260nm/OD280nm為1.9～2.0，表明總RNA完整性較好，無蛋白質(zhì)或DNA污染。利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1 200 bp左右清晰且特異性好的DNA片段(圖1)，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

M.DNA marker 100 bp；1.PCR 產(chǎn)物 Product of PCR

圖1綿羊TGFβ2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.1PCRamplificationresultofsheepTGFβ2gene

2.2 綿羊 TGFβ2基因及其剪切體CDS的克隆及重組子鑒定

將純化回收獲得的 PCR 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，利用 TGFβ2 基因 CDS 特異性引物鑒定重組質(zhì)粒，獲得約 1 200 bp 的插入片段(圖2)，與預(yù)期結(jié)果相符，測序后獲得綿羊 TGFβ2 基因 CDS序列全長1 329 bp，編碼 442 個(gè)氨基酸；另發(fā)現(xiàn) 2 個(gè)可變剪切體TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2，與主轉(zhuǎn)錄本TGFβ2相比，可變剪切體TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2分別編碼 331 和 414 個(gè)氨基酸， TGFβ2-AS1 缺失全部的第二外顯子序列和第六外顯子的 115 個(gè)堿基， TGFβ2-AS2 僅缺失第二外顯子(圖3)。此外，物種間的核苷酸序列相似性分析發(fā)現(xiàn)，克隆獲得的 TGFβ2 基因 CDS 與人類、小鼠、大鼠、牛、雞、狗、豬和斑馬魚的相似性分別為 94.28%、83.37%、88.71%、92.85%、79.53%、94.51%、94.81%和 67.80%，表明 TGFβ2 基因在各物種間具有較高的相似性。

M.DNA marker 100 bp；1～8.菌落PCR 產(chǎn)物 Product of colony PCR

圖2綿羊TGFβ2基因菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果
Fig.2ColonyPCRamplificationresultofsheepTGFβ2gene

2.3 綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì)分析 利用Protparam軟件對綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：綿羊TGFβ2蛋白分子質(zhì)量為50 550.99 ku,理論等電點(diǎn)為8.74，TGFβ2-AS1蛋白分子質(zhì)量為37 672.38 ku，理論等電點(diǎn)為 7.60,TGFβ2-AS2蛋白分子質(zhì)量為 47 691.71 ku，理論等電點(diǎn)為 8.82，綿羊TGFβ2及其剪切體TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2蛋白均由 20 種基本氨基酸組成(圖3)，其中：主轉(zhuǎn)錄本TGFβ2的氨基酸組成中絲氨酸(10.2%)含量最高，色氨酸(1.1%)最低，帶正電荷的殘基 59個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基 49個(gè)，蛋白的平均親水系數(shù)為 -0.406； TGFβ2-AS1蛋白氨基酸組成中亮氨酸(9.7%)含量最高，色氨酸(0.9%)最低，帶正電荷的殘基 39個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基 38個(gè)，蛋白的平均親水系數(shù)為-0.217；TGFβ2-AS2蛋白的氨基酸組成中亮氨酸(9.9%)含量最高，色氨酸(1.2%)最低，帶正電荷的殘基 58個(gè)，帶負(fù)電荷的殘基 48個(gè)，蛋白的平均親水系數(shù)為 -0.471 。

2.3.2 親水性/疏水性分析 如圖4所示，綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2第8位丙氨酸疏水性最強(qiáng)(最高分值2.856)；綿羊TGFβ2第 326 位精氨酸親水性最強(qiáng)(最低分值為-3.622 )，TGFβ2-AS1第 94 位絲氨酸親水性最強(qiáng)(最低分值為 -3.178 )， TGFβ2-AS2第298 位精氨酸親水性最強(qiáng)(最低分值為-3.622 )。

紅色下劃線表示信號肽序列，綠色下劃線表示跨膜區(qū) Red underline indicates signal peptide sequence,green underline indicates TGFβ2 protein transmembrane domains

圖3綿羊TGFβ2及其剪切體氨基酸序列分析
Fig.3TGFβ2anditssplicedvariantaminoacidsequencesinsheep

2.3.3 磷酸化與糖基化位點(diǎn)分析 利用 NetPhos 3.1 Server 軟件分析發(fā)現(xiàn)，綿羊TGFβ2蛋白有 33 個(gè)絲氨酸， 12 個(gè)蘇氨酸和 7 個(gè)酪氨酸； TGFβ2-AS1 有 22 個(gè)絲氨酸， 8 個(gè)蘇氨酸和 7 個(gè)酪氨酸；TGFβ2-AS2 有 30 個(gè)絲氨酸，10 個(gè)蘇氨酸和 7 個(gè)酪氨酸。根據(jù) NetNGlyc 1.0 Server 分析表明，綿羊TGFβ2及其剪切體均有 2 個(gè)糖基化位點(diǎn)。

2.3.4 信號肽及蛋白跨膜區(qū)分析 運(yùn)用SignalP server 4.1對綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果表明，均有1 個(gè)信號肽區(qū)域，位于 1～20 位氨基酸(圖3)；同時(shí)，利用TMHMM server 2.0軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2均為單跨膜蛋白(圖3)，即綿羊TGFβ2 1～4位氨基酸為胞內(nèi)部分，5～27 位氨基酸為跨膜螺旋部分，28～442 位氨基酸為胞外部分；綿羊 TGFβ2-AS1 1～4 位氨基酸為胞內(nèi)部分， 5～27 位氨基酸為跨膜螺旋部分，28～331 位氨基酸為胞外部分；綿羊 TGFβ2-AS2 1～4 位氨基酸為胞內(nèi)部分，5～27 位氨基酸為跨膜螺旋部分，28～414 位氨基酸為胞外部分。

2.3.5 亞細(xì)胞定位 根據(jù) PSORT II Prediction 預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，綿羊TGFβ2和 TGFβ2-AS2 在細(xì)胞中的定位結(jié)果是一致的，主要在胞外(44.4%)和細(xì)胞核(44.4%)中發(fā)揮作用，其余在線粒體中(11.1%)發(fā)揮作用， TGFβ2-AS1 主要在胞外(44.4%)發(fā)揮作用，少量作用于細(xì)胞質(zhì)(22.2%)、線粒體(22.2%)和細(xì)胞核(11.1% )。

2.3.6 蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測 綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2蛋白均由α-螺旋、延伸、β-折疊和無規(guī)則卷曲 4 種結(jié)構(gòu)組成，其中綿羊TGFβ2各種結(jié)構(gòu)所占比例分別為 38.69%、 16.74%、 8.14%和 36.43%， TGFβ2-AS1為 46.22%、 16.62%、 7.25%和 29.91%， TGFβ2-AS2為 39.13%、 16.43%、 8.70%和 35.75%，其中α-螺旋主要分布在位于細(xì)胞內(nèi)的氨基酸兩端。此外，蛋白三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)(圖 5)，綿羊TGFβ2及其剪切體均存在α-螺旋、β-折疊和disordred區(qū)域，其中綿羊TGFβ2蛋白存在 7 個(gè)α-螺旋區(qū)和 15 個(gè)β-折疊區(qū)， TGFβ2-AS1蛋白存在 5 個(gè)α-螺旋區(qū)和 13 個(gè)β-折疊區(qū)， TGFβ2-AS2蛋白存在 6 個(gè)α-螺旋區(qū)和 16 個(gè)β-折疊區(qū)。

圖4 綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白親水性分析Fig.4 Analysis of hydrophobicity sheep TGFβ2 and its spliced variant protein

圖5 綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure of sheep TGFβ2 and its spliced variant protein

2.4 綿羊TGFβ2蛋白同源性分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫下載人類、小鼠、大鼠、牛、雞、狗、豬和斑馬魚8個(gè)物種的 TGFβ2基因編碼蛋白序列，采用MegAlign 6.0軟件進(jìn)行蛋白同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綿羊 TGFβ2基因編碼蛋白與上述物種具有較高的同源性，綿羊TGFβ2氨基酸序列與人類、小鼠、大鼠、牛、雞、狗、豬和斑馬魚的同源性分別為 98.42%、90.27%、 95.02%、92.85%、83.48%、94.51%、94.81%和 67.80%。同時(shí)， TGFβ2編碼蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，綿羊與人類在系統(tǒng)進(jìn)化樹中的距離最近，與斑馬魚的距離最遠(yuǎn)(圖6)，提示綿羊 TGFβ2基因可能與人類具有相似的分子進(jìn)化模式，可能具有相似的分子功能。

圖6 9個(gè)物種TGFβ2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree constructed for TGFβ2 protein of 9 species

3 討 論

綿羊毛囊的發(fā)育始于胚胎形成時(shí)期，與毛囊發(fā)育相關(guān)的功能基因調(diào)控羊毛的形態(tài)學(xué)發(fā)生和毛品質(zhì)性狀的形成[22-26]。 TGFβ2基因在毛囊生長發(fā)育和周期調(diào)控過程中具有重要作用，是調(diào)控毛囊形成、基板向下生長和毛品質(zhì)性狀的重要候選功能基因[16,27-28]，然而，目前該基因?qū)d羊毛囊發(fā)育和周期性調(diào)控的分子功能鮮有報(bào)道，完整的綿羊 TGFβ2基因編碼區(qū)全長序列目前仍尚未獲得。本試驗(yàn)利用RT-PCR法首次克隆獲得綿羊 TGFβ2基因及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2的全長CDS， TGFβ2基因CDS全長 1 329 bp，其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2分別缺失 333 和 84 個(gè)核苷酸， CDS全長分別為 996和 1 245 bp。綿羊 TGFβ2基因與毛囊周期性轉(zhuǎn)導(dǎo)和毛囊真皮乳頭細(xì)胞凝集性發(fā)生的密切關(guān)系[29-30]，使人們?nèi)找嬷匾曉摶蛟诰d羊毛囊生長發(fā)育過程中的作用，但目前針對 TGFβ2基因及其可變剪切體調(diào)控綿羊毛囊發(fā)育的分子機(jī)制研究尚未開展，同時(shí)，雖然NCBI數(shù)據(jù)庫中有人類和小鼠 TGFβ2基因的一個(gè)可變剪接形式，但其對生物體生長發(fā)育的作用機(jī)制尚未闡明， TGFβ2及其可變剪切體的作用機(jī)制仍有待于深入分析。

可變剪切是導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能多樣性的重要原因，其在調(diào)控毛囊生長發(fā)育過程中具有重要作用。已有研究表明，F(xiàn)GF5及其剪切體在毛囊真皮乳頭細(xì)胞中相互拮抗調(diào)控毛囊生長發(fā)育和周期性轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[31]，同時(shí)，角蛋白相關(guān)蛋白及其剪切體在調(diào)控細(xì)毛羊毛品質(zhì)性狀形成過程中也發(fā)揮重要作用[32-33]。由此可知，基因可變剪切的發(fā)生能夠直接影響基因的功能和作用方式，它們在調(diào)控毛囊的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。本試驗(yàn)首次克隆獲得綿羊 TGFβ2基因及其剪切體編碼區(qū)全長序列，但目前 TGFβ2基因及其剪切體在綿羊毛囊生長發(fā)育和毛囊周期發(fā)生過程中的生物學(xué)功能仍知之甚少，在本研究的基礎(chǔ)上深入開展 TGFβ2基因及其剪切體在毛囊類細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律、分子功能和信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等方面的研究將為闡明毛囊生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

綿羊TGFβ2及其剪切體TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2蛋白分別編碼 442、331 和 414個(gè)氨基酸，均屬于I型跨膜蛋白，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，TGFβ2及其剪切體蛋白均含有 1 個(gè)信號肽區(qū)域和 1 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域。說明TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1和 TGFβ2-AS2蛋白是分泌性蛋白，在行使信號功能過程中發(fā)揮重要作用；另一方面，該蛋白的單跨膜結(jié)構(gòu)為配體特異性結(jié)合相關(guān)受體提供分子基礎(chǔ)。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白均由α-螺旋、延伸、β-折疊和無規(guī)則卷曲 4 種結(jié)構(gòu)組成，但這 4 種結(jié)構(gòu)所占比例各不相同,已有研究發(fā)現(xiàn)， TGFβ2氨基酸序列中6個(gè)高度保守的半胱氨酸(Cys)能夠通過鏈內(nèi)的二硫鍵連接β片層結(jié)構(gòu)形成一個(gè)半胱氨酸結(jié)，其在受體與配體的識別和作用方式上具有重要作用[34]，由此推測TGFβ2及其剪切體β片層結(jié)構(gòu)上存在的差異可能影響TGFβ2及其剪切體與受體的作用方式，從而在生物體內(nèi)行使不同的生物學(xué)功能。同時(shí)，蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白空間結(jié)構(gòu)比例亦存在差異，表明空間構(gòu)想的變化可能與蛋白功能的多樣性密切相關(guān)。此外，綿羊TGFβ2蛋白序列與人類、小鼠、大鼠、牛、豬和狗等哺乳動物具有較高的同源性，表明 TGFβ2基因可能是由同一個(gè)祖先基因遺傳進(jìn)化而來。其中，綿羊TGFβ2編碼的氨基酸序列與人類的序列相似性極高(98.42%)，這與系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果相一致， 推測綿羊 TGFβ2基因可能存在與人類 TGFβ2基因相似的生物學(xué)功能。本試驗(yàn)對綿羊TGFβ2及其剪切體蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析為進(jìn)一步闡明其在毛囊生長和毛品質(zhì)形成中的分子調(diào)控機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)首次克隆獲得綿羊TGFβ2及其剪切體 TGFβ2-AS1 和 TGFβ2-AS2 的 CDS，序列分析發(fā)現(xiàn) TGFβ2 基因 CDS 在物種間存在高度保守性。對TGFβ2及其剪切體蛋白理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽以及蛋白高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，為進(jìn)一步研究TGFβ2在綿羊毛囊發(fā)育和毛品質(zhì)性狀形成中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。