任磊 代光明 林梟 張東力 田冕 賀堯 許文娟 涂小林 黃偉*

1. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016

2. 重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院骨發(fā)育與再生實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016

骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少和骨組織微結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣?，?dǎo)致骨骼強(qiáng)度降低以及脆性增加的一種全身性代謝性骨病。骨質(zhì)疏松癥易引起骨折，尤其是髖部骨折，是中老年人致殘、死亡的重要原因之一[1]。現(xiàn)有抗骨質(zhì)疏松藥物多為抗骨吸收藥物，因此促進(jìn)成骨分化成為防治骨質(zhì)疏松的研究熱點(diǎn)[2]。

骨的發(fā)育從間充質(zhì)干細(xì)胞開始，歷經(jīng)祖細(xì)胞、前成骨細(xì)胞到成骨細(xì)胞，最終，多數(shù)成骨細(xì)胞凋亡，少數(shù)被其分泌的膠原蛋白包埋、繼續(xù)分化為發(fā)育終端的骨細(xì)胞[3]。該過程由其所棲息的微環(huán)境直接控制，受多條信號(hào)通路的時(shí)空調(diào)控。Wnt信號(hào)通路和Notch信號(hào)通路在骨生成代謝中起著重要的作用[4]。通過降低或增強(qiáng)Lrp5活性將分別導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和高骨密度綜合癥[5]。Notch信號(hào)通路有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用，并且在骨折愈合的過程中，Notch信號(hào)通路的受體和配體上調(diào)[6,7]。骨細(xì)胞是人體骨骼中最主要的細(xì)胞成分，在成年人骨骼中，骨細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)量的90%。隨著對(duì)骨細(xì)胞的研究加深，骨細(xì)胞被認(rèn)為具有應(yīng)力傳導(dǎo)功能和內(nèi)分泌功能[8]。

本實(shí)驗(yàn)組認(rèn)為骨細(xì)胞是Wnt/β-catenin信號(hào)通路產(chǎn)生骨合成代謝效應(yīng)的靶細(xì)胞[9]。前期發(fā)現(xiàn)體內(nèi)激活骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)導(dǎo)致骨合成代謝增強(qiáng)，成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增加并且骨量明顯增多，并且伴隨著骨硬化蛋白(sclerostin)轉(zhuǎn)錄和翻譯的增多，這說明骨細(xì)胞調(diào)控骨生成存在新機(jī)制。它不同于公認(rèn)的骨細(xì)胞調(diào)控骨形成機(jī)制，即力學(xué)刺激或PTH間歇注射下調(diào)骨硬化蛋白的表達(dá)，減少對(duì)Wnt受體Lrp5/6的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，增強(qiáng)Wnt信號(hào)，促進(jìn)骨生成。并且，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞Wnt信號(hào)激活的小鼠骨中Notch信號(hào)通路被大量激活。所以，我們?cè)诖藙?chuàng)新發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，提出“發(fā)育終端的骨細(xì)胞Wnt微環(huán)境因子反向調(diào)控骨發(fā)育”新假說。

本研究通過體外分離原代骨細(xì)胞，并與野生型小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，探究激活Wnt信號(hào)的骨細(xì)胞對(duì)BMSCs成骨分化的影響及其機(jī)制，以及Notch信號(hào)通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)老鼠：骨細(xì)胞wnt激活小鼠(daβcatot)是通過把骨細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的轉(zhuǎn)基因小鼠(由美國(guó)印第安納大學(xué)Teresita Bellido教授贈(zèng)予)和β-catenin第三號(hào)抑制性外顯子被LoxP序列修飾的小鼠(由日本Makoto M. Taketo教授贈(zèng)予)交配一代產(chǎn)生，同窩出生僅帶有LoxP序列修飾的小鼠作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠操作符合重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2主要試劑：胎牛血清(天津?yàn)笊锕?；αMEM 培養(yǎng)基(Gibico)；胰蛋白酶和青鏈霉素(HyClone)；一型膠原酶和β巰基乙醇(sigma)；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒和堿性磷酸酯酶定量檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Supermix(大連寶生物公司)；Realtime PCR引物皆由金斯瑞公司合成，引物序列參見表1。

1.2 方法

1.2.1基因型鑒定：采集小鼠標(biāo)本，于含蛋白酶K消化液56 ℃過夜消化，然后提取基因組DNA。接著行常規(guī)PCR反應(yīng)擴(kuò)增β-catenin和Cre基因，并于1%瓊脂糖凝膠行電泳分離。采集圖像。

1.2.2骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)分離與培養(yǎng)：骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)：取8月齡、雌性小鼠脫頸處死，無菌條件下取下雙側(cè)股骨、脛骨，剪去兩側(cè)骨骺端，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔。將骨頭剪成約1 mm大小碎片，轉(zhuǎn)移至6孔板中，加入1.5 mL 0.1%一型膠原酶消化三次(37 ℃，200rpm搖晃孵育，25 min)，然后交替利用含1%牛血清白蛋白(BSA)的5mmol/L EDTA溶液(37 ℃，200rpm搖晃孵育，10 min)和0.1%一型膠原酶溶液(37 ℃，200rpm搖晃孵育，25 min)反復(fù)各消化3次(共計(jì)9次消化)；收集骨碎片用于培養(yǎng)。每三天，半量更換培養(yǎng)基，至細(xì)胞長(zhǎng)至約皿底80%后，消化細(xì)胞，4×104/孔接種于24孔板，每三天，進(jìn)行半量換液。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離與培養(yǎng)：無菌條件下取8月齡、雌性小鼠股骨和脛骨，剪去兩側(cè)骨骺端，用注射器吸取培養(yǎng)基沖洗骨髓并收集，于200目過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。200 g，5min離心后棄上清，按2×106/孔加入到骨細(xì)胞中。

1.2.3堿性磷酸酶染色、定量，茜素紅染色：堿性磷酸酶染色：待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，吸棄培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗2次。接著加入福爾馬林固定液固定5 min，去離子水洗兩次。然后按試劑盒說明書加入染液。室溫避光反應(yīng)20～30 min后用去離子水洗去染液并觀察；堿性磷酸酶活性定量：吸棄培養(yǎng)基并潤(rùn)洗，然后每孔加入300 μL 50 mmol/L pH7.4 Tris，用槍頭將細(xì)胞全部刮下并收集于1.5mL EP管中。超聲破碎儀破碎細(xì)胞，接著于4 ℃、12000rpm離心3 min，收集上清。按試劑盒說明書每管加入50 μL樣品、50 μL緩沖液、50 μL顯色底物，混勻。37 ℃水浴并開始計(jì)時(shí)。當(dāng)液體出現(xiàn)黃色并逐漸加深至預(yù)期時(shí)(一般5～10 min)加入終止液終止反應(yīng)。在405 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)底物濃度曲線計(jì)算酶活性。

茜素紅染色：待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，吸棄培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗3次。95%酒精固定15 min，去離子水洗兩次，然后加入茜素紅試劑，室溫避光反應(yīng)30 min后，用去離子水洗去染液并觀察。

1.2.4RNA提取及RT-PCR：吸棄培養(yǎng)基，每孔加入200 μL TRIzol試劑，用槍頭吹打細(xì)胞并將液體轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管，室溫放置5 min后加1/5體積氯仿，旋渦振蕩15 s，室溫放置2 min。然后于12 000 g，4℃離心10 min。吸取上層水相，加入等體積冷異丙醇，15 000 g，4℃離心15 min，吸棄上清。加入300 μL 75%冷乙醇洗滌，然后7 500 g，4℃離心5 min，棄上清，空干。最后加入20 μL DEPC水溶解RNA，并測(cè)定其濃度；按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明于冰上依次加入2.0 μL 5xgDNA Eraser Buffer、1.0 μL gDNA Eraser、1μg RNA， RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μL。42 ℃水浴反應(yīng)2 min后放置冰上。接著向反應(yīng)液中加入1.0 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I、1.0 μL RT Primer Mix、4.0 μL 5x PrimeScript Buffer 2、4.0 μL RNase Free dH2O，混勻。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5min，4 ℃保存。

1.2.5Real-Time PCR：按照SYBR Green Supermix試劑盒說明說依次加入12.5 μL SYBR Premix Ex Taq II(2x)、正反引物各1 μL(10μmmol/L)、30ng cDNA, 用MiniQ水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；65 ℃到95 ℃每次上升0.5 ℃繪制溶解曲線。CHOB基因作為內(nèi)參，每組3個(gè)樣品。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS statistics 17統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組組間差異比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定

提取老鼠基因組DNA后對(duì)cre、β-Catenin的 flox序列進(jìn)行pcr鑒定，小鼠基因型分別為β-Catenin f/+,cre+; β-Catenin f/+,cre+; β-Catenin f/+,cre-; β-Catenin f/+,cre-(圖1(a))。結(jié)果表明20，21號(hào)小鼠骨細(xì)胞中β-Catenin被激活。

圖1 小鼠基因型鑒定Fig.1 Genotyping of the mice

圖2 堿性磷酸酶染色(a)、茜素紅染色(b)堿性磷酸酶活性定量(c)(*P<0.05)Fig.2 ALP staining (a), Alizarin red staining (b), and ALP activity assay (c)(*P<0.05)

2.2 Wnt信號(hào)激活的骨細(xì)胞促進(jìn)BMSCs成骨分化

成骨分化實(shí)驗(yàn)于共培養(yǎng)第10天行堿性磷酸酶(ALP)染色、茜素紅染色及成骨分化特異性標(biāo)志物基因水平檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，骨細(xì)胞Wnt/β-Catenin激活組：ALP活性明顯增加(圖2a)，鈣鹽沉積明顯增加(圖2b)，成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2 mRNA水平增加150%(圖3a)，堿性磷酸酶mRNA水平增加138%(圖3b)、生化活性高160%(圖2c)，骨生成代謝標(biāo)志物骨鈣蛋白的表達(dá)多274%(圖3c)。提示骨細(xì)胞Wnt信號(hào)促進(jìn)了BMSC的成骨分化。

圖3 成骨分化特異性標(biāo)志物mRNA表達(dá)情況(*P<0.05)Fig.3 mRNA expression of osteoblastic differentiation makers (*P<0.05)

2.3 Wnt激活的骨細(xì)胞表達(dá)更高的Notch信號(hào)配體

前期在小鼠體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)小鼠骨中Notch信號(hào)被激活，為了進(jìn)一步探討激活骨細(xì)胞Wnt信號(hào)促進(jìn)BMSCs成骨分化的機(jī)制，我們體外分離小鼠骨細(xì)胞，并檢測(cè)了Notch配體基因的表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照小鼠骨細(xì)胞相比，激活Wnt信號(hào)通路的骨細(xì)胞表達(dá)更高的Jag1、Jag2以及Dll-4(圖4)。

圖4 骨細(xì)胞Notch信號(hào)配體基因表達(dá)情況(*P<0.05)Fig.4 mRNA expression of ligands of Notch signaling pathway (*P<0.05)

2.4 阻斷Notch信號(hào)通路能抑制由骨細(xì)胞激活Wnt信號(hào)促進(jìn)的成骨分化

為了探討骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路促進(jìn)成骨與Notch信號(hào)通路的關(guān)系，我們體外通過Notch信號(hào)化學(xué)抑制劑DAPT來阻斷共培養(yǎng)體系中細(xì)胞的Notch信號(hào)后，再次檢測(cè)BMSCs成骨分化的情況，ALP染色及生化定量結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，激活骨細(xì)胞Wnt信號(hào)ALP活性增高137.1%，而DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，ALP活性比對(duì)照組降低69.8%(圖5)。另外激活骨細(xì)胞Wnt信號(hào)后Notch信號(hào)靶基因HeyL mRNA表達(dá)升高535.1%(圖6d)、Hey1 mRNA升高無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6c)，成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2 mRNA表達(dá)升高1077.5%(圖6a)，成骨分化特異標(biāo)志物ALP mRNA升高179.4%(圖6b)。而加入DAPT后Notch信號(hào)靶基因HeyL mRNA表達(dá)下降22037.9%(圖6d)，成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2mRNA表達(dá)下降2852.3%(圖6a)，成骨分化特異標(biāo)志物ALP mRNA下降563.2%(圖6b)。

圖5 DAPT阻止Notch信號(hào)后ALP染色(a)和ALP生化定量(b)(*P<0.05)Fig.5 ALP staining (a) and ALP activation quantification (b) after addition of Notch signaling inhibitor DAPT (*P<0.05)

圖6 DAPT阻止Notch信號(hào)后成骨分化特異標(biāo)志物mRNA表達(dá)(a,b)以及Notch信號(hào)通路下游基因mRNA表達(dá)(c,d)(*P<0.05)Fig.6 Effect of Notch signaling inhibitor DAPT on the expression of osteogenic differentiation marker (a, b) and Notch signaling downstream genes (c,d)(*P<0.05)

3 討論

骨質(zhì)疏松及其引起的骨折是威脅中老年人生命健康以及加劇社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)的常見疾病。基于干細(xì)胞的骨再生技術(shù)對(duì)骨質(zhì)疏松和骨缺損等許多疾病的治療極為重要，其中調(diào)控干細(xì)胞自我更新及成骨定向分化是該技術(shù)的關(guān)鍵。然而目前間充質(zhì)干細(xì)胞成骨定向分化的理想微環(huán)境尚未明確[10]。

骨細(xì)胞是人體骨骼中最主要的細(xì)胞成分,在成年人骨骼中，骨細(xì)胞約占細(xì)胞總數(shù)量的90%。近幾年對(duì)骨細(xì)胞的研究逐漸加深，骨細(xì)胞被認(rèn)為具有應(yīng)力傳導(dǎo)功能和內(nèi)分泌功能。骨細(xì)胞可以感受機(jī)械應(yīng)力并將其轉(zhuǎn)化為生物信號(hào)，從而根據(jù)外界力學(xué)環(huán)境的變化，調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞進(jìn)行骨骼重建。間斷的 PTH 釋放能夠增強(qiáng)骨細(xì)胞的生存活性，并抑制骨細(xì)胞分泌骨硬化蛋白從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性[8]。

Notch信號(hào)通路廣泛存在于細(xì)胞間，在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)通路有5種配體，分別為Jagged1、2和 Delta 1、3、4；以及4種受體，分別為 Notch1、2、3、4。有研究表明，Notch 信號(hào)通路有促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用[6]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，在骨折愈合的過程中，Notch信號(hào)通路的受體和配體上調(diào)[7]。

Wnt信號(hào)通路與骨生成代謝緊密相關(guān)。在經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路中，Wnt結(jié)合其受體Frizzled和相關(guān)受體低密度脂蛋白(Lrp)5/6后，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中保持穩(wěn)定狀態(tài)，從而進(jìn)入細(xì)胞核作用于轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef，激活Wnt信號(hào)靶基因表達(dá)[4]。通過降低或增強(qiáng)Lrp5活性將分別導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和高骨密度綜合癥[5]。Wnt信號(hào)對(duì)成骨發(fā)育的調(diào)控功能是由細(xì)胞類型決定，即對(duì)細(xì)胞發(fā)育的各階段有不同的影響。成骨發(fā)育早期，間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞及早期成骨細(xì)胞的Wnt信號(hào)促進(jìn)成骨分化。敲除β-catenin分別導(dǎo)致無成骨細(xì)胞和無骨形成[11-13]；但成骨發(fā)育晚期，成骨細(xì)胞敲除β-catenin對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)育分化沒有影響，僅降低Wnt靶基因OPG表達(dá)而導(dǎo)致骨吸收增強(qiáng)，造成骨流失[14]。而且激活成骨細(xì)胞β-catenin，也只是觀察到上調(diào)OPG而抑制骨吸收，引起骨量增加[15]。有研究報(bào)道激活成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin將上調(diào)Notch信號(hào)配體Jag1的表達(dá)，可引起小鼠急性白血病，導(dǎo)致其圍產(chǎn)期死亡[16]。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過激活骨細(xì)胞β-catenin發(fā)現(xiàn)顯著增強(qiáng)BMCSs的成骨分化。這表明對(duì)Wnt/β-catenin產(chǎn)生骨合成代謝效應(yīng)的細(xì)胞不是成骨細(xì)胞，而是骨細(xì)胞。

基于前期我們課題組的重大發(fā)現(xiàn)，即體內(nèi)激活骨細(xì)胞Wnt信號(hào)顯著增加成骨細(xì)胞及骨量[11]。這說明骨細(xì)胞Wnt微環(huán)境促進(jìn)骨形成。為了進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本研究通過體外分離Wnt信號(hào)激活的骨細(xì)胞，并與野生型小鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)：骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通過調(diào)節(jié)其Notch配體的表達(dá)而增強(qiáng)BMSCs成骨分化。

骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路是骨生成代謝的重要因素[17]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械刺激引致的骨合成代謝是通過下調(diào)骨細(xì)胞Sost基因表達(dá)、增強(qiáng)Wnt信號(hào)，從而促進(jìn)骨形成[12]。由Sost基因編碼的sclerostin蛋白是Wnt相關(guān)受體Lrp5/6的競(jìng)爭(zhēng)性抑制物，被稱為骨形成抑制劑。其在骨細(xì)胞里表達(dá)、分泌，卻不在成骨細(xì)胞里表達(dá)，這是公認(rèn)的骨細(xì)胞調(diào)控骨形成的機(jī)制之一[18]。但是我們前期研究發(fā)現(xiàn)激活骨細(xì)胞β-catenin將增強(qiáng)骨形成，同時(shí)其sclerostin表達(dá)也顯著增加，這不同于目前作用機(jī)制。表明骨細(xì)胞調(diào)控骨生成存在新機(jī)制，而本研究我們發(fā)現(xiàn)激活骨細(xì)胞β-catenin將增加其Notch信號(hào)配體的表達(dá)，這和發(fā)現(xiàn)激活成骨細(xì)胞Wnt信號(hào)通路增加Jag1的表達(dá)類似。而且我們通過化學(xué)抑制劑DAPT抑制Notch信號(hào)通路后發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞Wnt增加成骨分化的現(xiàn)象被抑制了，這表明骨細(xì)胞Wnt調(diào)控成分化的作用機(jī)制是通過調(diào)節(jié)自身Notch配體的表達(dá)而進(jìn)一步激活BMSCs的Notch信號(hào)通路，從而調(diào)控其成骨分化。并且前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)骨細(xì)胞Wnt/β-catenin激活不會(huì)引起白血病或早期死亡，表明骨細(xì)胞經(jīng)典Wnt通路具有相對(duì)較好的生物安全性。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)發(fā)育終端的骨細(xì)胞通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路反向調(diào)控骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化，確定以骨細(xì)胞為靶點(diǎn)、精確調(diào)控BMSCs成骨，為修復(fù)骨組織再生和構(gòu)建組織工程骨提供基礎(chǔ)。