周廣文 向楠* 周亞娜 胡婭 曾明星 李家圓

1. 湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065 2. 湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061 3. 長江大學，湖北 荊州 434023

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是以骨強度下降、骨折風險增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病[1]。骨強度包括骨密度和骨質(zhì)量兩個方面，其中正常的骨礦化對維持骨強度具有重要的作用。在OP的發(fā)病過程中，骨代謝異常與骨礦化異常往往互為因果。近10余年來，大量研究證實中醫(yī)藥治療OP有其獨特的優(yōu)勢[2]，可以提高骨密度、改善疼痛。而我們的課題組多年來從事補腎化痰方防治OP的臨床與基礎研究[3,4]，通過前期的一系列研究證實了從痰論治骨質(zhì)疏松的可行性[5]。此外，我們認為從痰論治骨質(zhì)疏松還可以從調(diào)節(jié)鈣沉積入手[6]。因此，本研究旨在探討補腎化痰方對骨鈣相關(guān)蛋白的影響，進一步明確其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1藥物制備：補腎方：菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補骨脂15 g；補腎化痰方：菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補骨脂15 g、全瓜蔞15 g、紅曲12 g、山楂20 g。生藥均由湖北省中醫(yī)院門診部藥房提供，加水煎煮濃縮而成，貯存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2試劑：大鼠Fetuin-A試劑盒(貨號JYM1043Ra)、MGP試劑盒(貨號JYM1036Ra)；大鼠Fetuin-A抗體(貨號Ab203582)、大鼠MGP抗體(貨號Ab192396)。

1.1.3實驗動物：6月齡雌性 SD 大鼠，SPF 級，由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供，許可證號SCXK(鄂)42000600017470。

1.1.4儀器：MK3 酶標儀(芬蘭Labsystems Multiskan MS公司)、Tanon-5200 全自動化學發(fā)光分析儀(上海天能公司)、RM2235石蠟切片機(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)、uCT50(瑞士 SCANCO MEDICAL)

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立和分組：大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，隨機分為假手術(shù)組、模型組、補腎組和補腎化痰方組。除假手術(shù)組外，其他各組行卵巢切除術(shù)。按照(30 mg/ kg體重)的比例，使用麻醉藥物(1%戊巴比妥鈉)腹腔注射麻醉。無菌條件下，大鼠俯臥位固定，在背側(cè)正中切口進入腹腔，在腎下極附近找到卵巢，用4號線結(jié)扎并摘除雙側(cè)卵巢，分層縫合切口。假手術(shù)組術(shù)式相同，但只切除卵巢周圍與雙側(cè)卵巢重量等同的脂肪組織，保留卵巢。術(shù)后5 w開始灌胃給藥。補腎組以0.51 g/mL中藥藥液灌胃，補腎化痰組以0.94 g/mL中藥藥液灌胃，模型組和假手術(shù)組灌以等體積的生理鹽水，1 mL/100 g，每天1次，給藥時間為8 w。期間各組大鼠分籠常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水。

1.2.2骨密度檢測：四組大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死，取出每只大鼠左側(cè)股骨，固定在Micro-CT 載物臺上對股骨近干骺段進行 X 射線掃描。沿大鼠股骨長軸方向掃描股骨遠端，以 360°掃描角度、15 μm 的掃描分辨率，獲取連續(xù)的平面μCT 圖像。掃描完成后，選取感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)進行三維重組，本次研究以生長板遠端 1.0 mm、層厚 2. 0 mm 的骨組織作為松質(zhì)骨ROI，設定最低閾值為 170，提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用 Micro-CT 自帶的軟件進行定量分析。主要檢測參數(shù)包括骨密度BMD等。

1.2.3血清Fetuin-A、MGP檢測：12 w末，大鼠摘除雙側(cè)眼球取血，置于肝素抗凝管內(nèi)，于30 min內(nèi)3 000 r/m離心10 min，取上清，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｑ錐etuin-A、MGP水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行檢測，測定參照試劑盒說明。

1.2.4骨組織Fetuin-A、MGP檢測：右側(cè)股骨洗凈后取部分骨片放入組織保存液中于4 ℃保存，提取蛋白，用Western blot法檢測骨組織Fetuin-A、MGP蛋白的表達，其余部分放入4%多聚甲醛固定液中固定，脫鈣，免疫組化檢測其定位。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 一般觀察

大鼠在麻醉3～4 h后完全清醒，正常進食。24 h后切口無紅腫，可正?；顒樱?2 h后切口無感染征象。1 w后切口完全愈合，縫線脫落。

2.2 補腎化痰方對去卵巢大鼠骨密度及血清指標的影響

與假手術(shù)組相比，模型組、補腎化痰組及補腎組的BMD、Fetuin-A、MGP 水平明顯降低。補腎化痰方和補腎方都能顯著提高去卵巢大鼠BMD、血清Fetuin-A、MGP(P<0.001)，但兩組間比較，BMD差異并沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05),而補腎化痰方改善血清Fetuin-A、MGP水平的作用強于補腎方(P<0.001)。 見表1。

表1 補腎化痰方對去卵巢大鼠骨密度及血清指標的影響Table 1 Effect of nourishing kidney and dissipating phlegm prescription on BMD and serum indexes

注：與假手術(shù)相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與補腎化痰組相比，△P<0.05，&P>0.05

2.3 補腎化痰方對去卵巢大鼠骨組織Fetuin-A、MGP水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組、補腎化痰組及補腎組的骨組織Fetuin-A水平明顯降低，MGP水平明顯升高(P<0.001)；補腎化痰方和補腎方均能提高去卵巢大鼠骨組織Fetuin-A水平而降低MGP的水平(P<0.001)，但兩相比較，差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(見表2、圖1)。

表2 補腎化痰方對去卵巢大鼠骨組織指標的影響Table 2 Effect of nourishing kidney and dissipating phlegm prescription on bone tissue indexes

注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05；與補腎化痰組相比，&P>0.05

圖1 各組大鼠骨組織中fetuin-A和MGP 的蛋白印記圖Fig.1 Electrophorogram of fetuin-A and MGP of the bone tissue of rats in each group

IHC的結(jié)果顯示Fetuin-A的陽性表達位于骨髓基質(zhì)細胞胞漿及骨小梁周邊的成骨細胞，MGP的陽性表達位于骨髓基質(zhì)細胞胞漿和骨小梁周邊的成骨、破骨細胞表達，與文獻報道一致[7](圖2、3)。

圖2 各組大鼠骨組織中Fetuin-A 的免疫組織化學染色結(jié)果Fig.2 Immunohistochemical staining of fetuin-A in the bone tissue of rats in each group

圖3 各組大鼠骨組織中MGP 的免疫組織化學染色結(jié)果Fig.3 Immunohistochemical staining of MGP in the bone tissue of rats in each group

3 討論

在OP的發(fā)病過程中，伴隨著骨代謝的異常如速率的下降和增快，都會產(chǎn)生一定的骨量丟失，而這部分骨量丟失會通過生物體自身的激素調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生對鈣/磷分布的影響，從而導致鈣沉積異常的發(fā)生，因此，骨代謝異常與骨礦化異常，往往互為因果，共同影響OP的發(fā)病。病理狀態(tài)下，鈣從骨組織流失而異常沉積于其他部位，是OP發(fā)生與加重的原因之一。

生物體內(nèi)的礦化是具有選擇性的，鈣在骨骼、牙齒、生長板軟骨等硬組織的沉積屬于正常的生物礦化過程，而鈣在血管，腎臟，關(guān)節(jié)軟骨和心血管組織等軟組織的沉積鈣化則屬于病理性的異位礦化[8]。顯然在維持正常的生物礦化的過程中，同時存在著礦化促進機制與抑制機制，兩者同等重要[9]。在血液中，F(xiàn)etuin-A可與MGP鈣、磷等礦物質(zhì)前體結(jié)合形成復合體[10]，即胎球蛋白-基質(zhì)gla蛋白-鈣磷礦化復合物(Fetuin A-MGP-Calcium phosphate mineral complex，F(xiàn)MC)。血液中FMC的形成，能夠防止礦物離子的聚積，維持其穩(wěn)定；并且可以通過從細胞外液中，將逐漸成熟且不可溶的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)移到目的礦化位點，使得礦化的反應鏈繼續(xù)發(fā)展[11]。本次研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)相比，去勢骨質(zhì)疏松癥大鼠的血清Fetuin-A及血清MGP水平均降低，這與我們的前期臨床研究結(jié)果一致[12]。OP時，破骨細胞功能活躍，骨組織的鈣離子大量外流，血清中鈣離子增多，但此時血清Fetuin-A、MGP水平降低，F(xiàn)MC的合成是減少的。因此血清中的鈣離子得不到穩(wěn)定而大量聚集在異位鈣化區(qū)，從而影響了正常的骨礦化過程。

基質(zhì) Gla 蛋白(matrix gla protein，MGP)是礦鹽沉積的重要抑制物，是體內(nèi)研究中首次報道的血管和軟骨鈣化的抑制劑[3]。研究發(fā)現(xiàn)，在血管鈣化的過程中，MGP可與BMP2結(jié)合，抑制BMP2的表達[14,15]。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，去勢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織MGP表達是增多的。我們推測骨組織中MGP的表達增多，一方面可能會抑制骨組織鈣鹽的沉積，另一方面可能通過抑制BMP2的表達，影響成骨細胞的分化與成熟，從而影響OP的發(fā)生。

中醫(yī)認為OP/PMOP屬于“骨痿”、“骨痹”等范疇，現(xiàn)代學者普遍認為其發(fā)生與腎精虧損、脾胃虛弱、肝血虧虛、瘀血阻絡4個因素有關(guān)[16]，并多從這幾個方面入手，辯證施治[17]。而我們的課題組基于對痰濁在OP發(fā)病中作用的認識，結(jié)合“腎主骨，生髓”的中醫(yī)基礎理論，提出了“脂代謝異?？赡芘c骨質(zhì)疏松癥痰濁有關(guān)”的假說，制定了補腎化痰的新治則，從“痰”論治骨質(zhì)疏松[5]，并進行一系列的前期研究[18-21]。此外，根據(jù)正常的鈣代謝在人體內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)作用及鈣的異常沉積引起的病理表現(xiàn)[22]，我們認為，鈣的異常沉積應屬于中醫(yī)“痰”的范疇。因此，從痰論治骨質(zhì)疏松，還可以從調(diào)節(jié)骨礦化及異位鈣化的角度入手[6]，通過對骨鈣相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)，促進正常的骨礦化而抑制異位鈣化，從而達到治療OP的目的。而本次研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，補腎方與補腎化痰方均可以提高去勢骨質(zhì)疏松大鼠的BMD，提高血清FMC的表達，并降低骨組織MGP的表達，我們認為中藥改善OP的作用在于一方面促進FMC的表達，使得血中的鈣離子得到穩(wěn)定，能夠參與正常的鈣化過程，從而促進正常骨礦化的進行；另一方面通過減少MGP在骨組織局部的聚集，降低MGP對骨礦化的抑制作用。兩組間比較，補腎化痰方的作用優(yōu)于補腎方，表明其對鈣化過程的影響主要與其化痰功能有關(guān)。

本次研究僅對去勢骨質(zhì)疏松大鼠的骨組織進行了研究，探究了FMC對骨礦化的影響，沒有能夠同時研究異位鈣化的部位，如血管鈣化的變化，因此FMC在機體整體的作用變化還有待進一步的研究。