柴生颋 謝平金 萬(wàn)雷 林勇

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510240 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510405 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見(jiàn)的骨疾病之一，它是以一種由于骨強(qiáng)度降低而使骨折風(fēng)險(xiǎn)升高的全身性骨骼疾病，目前已在世界常見(jiàn)病多發(fā)病中居第七位，成為世界性前沿研究難題。且隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)，OP的發(fā)病率目前正以驚人的速度增長(zhǎng)，防治骨質(zhì)疏松癥已成為當(dāng)今國(guó)際上的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)，補(bǔ)腎健脾活血方含藥血清對(duì)UMR106細(xì)胞成骨分化和骨形成相關(guān)蛋白的影響，以期從細(xì)胞分子學(xué)角度探討補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)防治OP的作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞

購(gòu)置UMR106細(xì)胞(上海中科院)；4月齡 SD 雌性大鼠40只， 用于制備含藥血清。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎健脾活血方(淫陽(yáng)藿10 g、熟地黃10 g、肉蓯蓉10 g、大棗10 g、當(dāng)歸10 g、 丹參10 g、菟絲子10 g、補(bǔ)骨脂10 g、黃芪10 g、白芍10 g)，并在本院制劑室常規(guī)水煎制，濃縮，生藥含量為1.43 g/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥：戊酸雌二醇片(補(bǔ)佳樂(lè)，J20130009)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑儀器及器械

UMR106細(xì)胞完全培養(yǎng)基配制：DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat. No.SH 30022.01B)+10%胎牛血清(Gibco，Cat. No.10099-141)+1%雙抗(100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素)，4 ℃放置，37 ℃水浴溫浴后使用；CCK8檢測(cè)工作液配制：10 μL CCK8檢測(cè)原液+100 μL細(xì)胞完全培養(yǎng)基，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；青鏈霉素，PBS緩沖液，胰酶(GENVIEW，Cat.No.9002-07-7)，ALP測(cè)試盒南京建成(A059-1)Cell Counting Kit-8(Dojindo，Cat.No.CK04)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司)；低速離心機(jī)(Anke/飛鴿TDL-80-2B)；倒置顯微鏡(MOTI)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Memmer，INC108)；酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(Thermo Fisher Scientific，multiscan MK3)；ALP 測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，A059-1)。上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品水平離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品，TDL-80-2B)；普通培養(yǎng)箱(日本SANYO公司產(chǎn)品，DHP-02.420)； HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市晨陽(yáng)電子儀器廠，XMTD203)；Thermo酶標(biāo)儀(MULTISKAN MK3)；pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，02220128)；臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-80-2B)；恒壓恒流電泳儀(北京市六一儀器廠，DYY-6C)；冷凍高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，Hema TGL-16R)；氣一電流儀(JUNY1，JY300)；容聲柜式冰箱(青島海爾特種電器有限公司，BD/C310)；立式超低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司，DW-86L486)；掃描儀(MICROTEK，Bio-5000)；AX-Ⅱ X射線(xiàn)攝影暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械， 127 mm×178 mm)；SDS-PAGE垂直電泳槽(北京凱元伯樂(lè)生物科技有限公司，MP-8001)；漩渦振蕩器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司，XW-80 A)；超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，JY 92-IIN)；多用脫色搖床(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司，XK-8)；磁力攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司，78)；Tris-base、Glycine、 SDS(十二烷基硫酸鈉)(上海生工，TB0194-2.5KG/GB0235-2.5KG/SB0485-500G)；PVDF膜(Millipore，IPVH00010)；醫(yī)用X-光片(廣西巨星醫(yī)療器械有限公司，SUPER RX-N-C 5×7)；Acrylamide(丙烯酰胺)、BIS-Acrylamide(雙丙烯酰胺)(Genview，GA006-500G/GN199-25G)；Ammonium persulphate(過(guò)硫酸銨)(GENVIEW，GA019-50G)；蛋白定量試劑盒(Thermo，23227)；裂解液(碧云天，P0013)；DTT(二硫代蘇糖醇)碧云天(ST040)；PMSF(苯甲基磺酰氟)、溴汾藍(lán)(Genebase，329-98-6/ 115-39-9)。

1.4 含藥血清的制備

將4月齡 SD 雌性大鼠40只，隨機(jī)分成 5 組、每組 8只。低劑量組按2.4 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃，中劑量組按4.8 g生藥 /kg 大鼠體重灌胃，高劑量組按9.6 g生藥 /kg；陽(yáng)性對(duì)照組每只大鼠灌胃大約戊酸雌二醇片0.1 g/ kg(用生理鹽水溶至1 mL)；空白血清組每只大鼠灌胃生理鹽水大約20 mL/ kg。每天2次， 間隔5 h，，連續(xù)6天。第7天進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，并分離血清，過(guò)濾后分裝，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 UMR106細(xì)胞的培養(yǎng)

①UMR106 細(xì)胞體外培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(4 ℃放置，37 ℃水浴溫浴后使用)，取出長(zhǎng)至80%的UMR106細(xì)胞，吸掉舊培養(yǎng)液；用PBS洗滌細(xì)胞一至二次；加入胰酶溶液，輕洗細(xì)胞皿底部，吸掉胰酶溶液，放入37 ℃培養(yǎng)箱2～3 min，于倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，加入新鮮完全培養(yǎng)基，使用移液器將細(xì)胞吹勻，制備單細(xì)胞懸液；②計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL；取出96孔板，接種100 μL密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，次日，按：正常大鼠血清組；低劑量含藥血清組；中劑量含藥血清組；高劑量含藥血清組；陽(yáng)性對(duì)照組；分組進(jìn)行加藥，分別培養(yǎng)72 h。③細(xì)胞處理結(jié)束的前4 h，吸去培養(yǎng)液，按每100 μL完全培養(yǎng)基加入10 μL CCK-8將二者混合均勻后，每孔加入100 μL的CCK-8混合液，避免產(chǎn)生氣泡，將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，4h后，將96孔板中的培養(yǎng)基移至酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD殖。

1.6 ALP 活性的測(cè)定

ALP 活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn)A059-1)檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)72 h后的ALP 活性，酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A520 nm殖。并計(jì)算血清中ALP活力。

計(jì)算公式：

血清中AKP活力(金氏單位/100ml)=

1.7 OPN、RUNX2、BMP-2蛋白檢測(cè)

各組經(jīng)血清分別培養(yǎng)72 h后，按比例加入裂解液，充分裂解后，120 000 g離心2～5 min，取上清液。提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。加入5×SDS蛋白上樣緩沖液(5∶1)，100 ℃煮沸5 min。-20 ℃保存?zhèn)溆?。分別至于濃縮膠和分離膠中電泳，350mA轉(zhuǎn)膜70 min。37封閉液中封閉1 h；將PVDF膜分別放入裝有3 mL稀釋后的OPN(稀釋比例1∶8000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜35 min，廠家：Abcam，貨號(hào)：ab91655)抗體、RUNX2(稀釋比例1∶1000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜60 min，廠家：Abcam，貨號(hào)：ab23981)抗體、BMP-2(稀釋比例1∶4000，轉(zhuǎn)膜條件：300 mA恒流轉(zhuǎn)膜40 min，廠家：Abcam，貨號(hào)：ab183729)抗體，25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min；將PVDF膜放入含有3 mL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的稀釋二抗溶液的小槽內(nèi)，置于搖床上室溫平緩搖動(dòng)40 min(二抗：HRP Goat anti-Rabbit IgG(廠家：BOSTER，貨號(hào)：BA1054，稀釋比例：1∶20000，孵育條件：室溫孵育40 min)25 mL TBST洗滌PVDF膜3次，每次7 min；用化學(xué)發(fā)光顯色后進(jìn)行圖像分析，經(jīng)軟件分析，以O(shè)PN/GAPDH、RUNX2/GAPDHBMP-2/GAPDH比值表示OPN、RUNX2、BMP-2蛋白表達(dá)水平

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清對(duì)UMR106細(xì)胞ALP活性的影響

如表1所示，與空白血清組比較，中劑量血清組、高劑量血清組和陽(yáng)性對(duì)照組加藥干預(yù)72 h后，細(xì)胞吸光度值均較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽(yáng)性對(duì)照組加藥干預(yù)72 h后，細(xì)胞ALP活性均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨著中藥血清水平升高，ALP活性越高。

表1 各組血清對(duì)UMR106細(xì)胞增殖和ALP活性的影響Table 1 Effect of the serum on the cell proliferation and ALP activity in UMR106 cells of each group

注: 與空白血清組比較，*P<0. 05

2.2 各組UMR106細(xì)胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平

3 討論

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是臨床常見(jiàn)的骨疾病之一，它是以一種由于骨強(qiáng)度降低而使骨折風(fēng)險(xiǎn)升高的全身性骨骼疾病。由于骨質(zhì)疏松時(shí)骨強(qiáng)度下降，在生活中輕微外力作用下即可造成骨折，骨折作為OP最嚴(yán)重的并發(fā)癥和早期死亡的危險(xiǎn)因素之一[1]，給患者及社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。

圖1 各組UMR106細(xì)胞中的OPN、RUNX2、BMP-2蛋白水平注: 與空白血清組比較，*P<0. 05Fig.1 The protein concentrations of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells of each group

圖2 各組UMR106細(xì)胞中OPN、RUNX2、BMP-2表達(dá)凝膠電泳圖Fig.2 The expression of OPN, RUNX2, and BMP-2 in UMR106 cells in each group

中醫(yī)認(rèn)為OP屬于“骨痿”范疇，其病位在腎，發(fā)病關(guān)鍵是“腎虛”。隨著年齡增長(zhǎng)，腎中精氣由充盛轉(zhuǎn)而逐漸衰敗，性腺功能亦隨之漸漸衰退。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，結(jié)合臨床體會(huì)，我們認(rèn)為腎虛是OP的主要病因，并由此篩選補(bǔ)骨脂、淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子、黃芪等中藥組成了治療骨質(zhì)疏松癥的補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)。成骨細(xì)胞作為參與骨生成、生長(zhǎng)、吸收及代謝的關(guān)鍵細(xì)胞，具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機(jī)成分，對(duì)骨生長(zhǎng)有重要作用；此外，細(xì)胞表面存在多種骨吸收刺激因子的受體，細(xì)胞并能分泌一些細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。因此，鑒定新的重要的成骨細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，深入研究骨發(fā)育和骨重塑的分子機(jī)制，就顯得非常必要。我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)可以增加PMOP患者骨密度[2]，且其含藥血清對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均有影響，可改變細(xì)胞生存環(huán)境中OPG/ RANKL的比例，間接影響著破骨細(xì)胞的功能活性[3]。

本實(shí)驗(yàn)采用的大鼠類(lèi)成骨細(xì)胞UMR106，保留了成骨細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)上獨(dú)有的特征，具有穩(wěn)定、均一、純度高、易于培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于代替成骨細(xì)胞的細(xì)胞系，并用于研究各種調(diào)控骨質(zhì)疏松的激素、生長(zhǎng)因子在細(xì)胞水平上治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制[4-6]。故本實(shí)驗(yàn)選取UMR106作為代替成骨細(xì)胞，以研究補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)，在促進(jìn)成骨分化中的作用。堿性磷酸酶作為成骨細(xì)胞分化早期分泌和高表達(dá)的標(biāo)志酶，具有一定的特異性標(biāo)志[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽(yáng)性對(duì)照組加藥干預(yù)72 h后，細(xì)胞吸光度值均較低(P<0.05), 而隨著含藥血清水平的增加，對(duì)UMR 106細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用相對(duì)減弱；與空白血清組比較，低、中、高劑量血清組和陽(yáng)性對(duì)照組加藥干預(yù)72 h后，細(xì)胞ALP活性均較高(P<0.05)，且隨著中藥血清水平升高，ALP活性越高。這充分說(shuō)明骨康含藥血清對(duì)能明顯提高UMR 106的成骨分化，且劑量水平越高，ALP活性越高。

OPN是一種分泌型的糖基化磷酸化蛋白，分子結(jié)構(gòu)較特殊，富含精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸，包含大量高度保守功能序列，作為成骨細(xì)胞成熟和分化過(guò)程的標(biāo)志性因子在細(xì)胞黏附和基質(zhì)礦化中發(fā)揮著重要作用[8]。RUNX2 作為成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子和成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子，不僅能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化，還可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成熟，在胚胎發(fā)育過(guò)程中，RUNX2 的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的開(kāi)始，RUNX2 的缺失將導(dǎo)致骨發(fā)育不良或終止[9-10]。亦有研究[11]表明，BMP-2能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，具有高效的誘導(dǎo)成骨活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，經(jīng)補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)含藥血清培養(yǎng)后UMR106細(xì)胞OPN、RUNX2、BMP-2均顯著上調(diào)，且呈濃度梯度性變化，各中藥含藥血清組以高劑量組表達(dá)最為明顯，這表明補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)能夠通過(guò)上調(diào)OPN、RUNX2、BMP-2從而促進(jìn)UMR106細(xì)胞成骨分化。

綜上所述，補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)含藥血清對(duì)成骨樣細(xì)胞UMR106成骨分化具有促進(jìn)作用，并能上調(diào)OPN、RUNX2、BMP2等相關(guān)骨形成蛋白的表達(dá)。但OPN、RUNX2、BMP2因子表達(dá)上調(diào)后能否進(jìn)一步激活成骨細(xì)胞特異性的下游靶基因、實(shí)現(xiàn)的具體途徑如何，還有待進(jìn)一步的研究。細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用表明其具有被開(kāi)發(fā)為抗骨質(zhì)疏松藥物的潛力，下一階段將重點(diǎn)研究補(bǔ)腎健脾活血方(骨康方)含藥血清調(diào)節(jié)成骨樣細(xì)胞UMR106的分子機(jī)制，為補(bǔ)腎健脾活血方在防治OP方面，提供新的科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。