鄭 雪，王慧娜，朱彥秋，丁衛(wèi)凱，李嬌嬌，周延清，段紅英

(河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

胡黃連(Picrorrhizaroyle) 別名假黃連，生于高山草地及礫石堆，分布海拔約為4 400 m。胡黃連是玄參科(Scrophulariaceae)胡黃連屬(Picrorrhizaroyle)植物的干燥根狀莖，可入藥，性寒、味苦。胡黃連作為印度和中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，用藥歷史久遠(yuǎn)，具有涼血止血、清熱利濕、解毒消疳的作用[1]，主要用于調(diào)治驚癇黃疸、濕熱瀉痢、痔瘺瘡瘍等癥[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，胡黃連具有利膽保肝[4]、消炎抗菌[5-6]、保護(hù)神經(jīng)[7]、抗哮喘[8]、免疫活性[9]和降血糖[10]等多種藥理作用，臨床應(yīng)用廣泛。胡黃連中主要的次生代謝產(chǎn)物是環(huán)烯醚萜苷等萜類(lèi)物質(zhì)，其環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分中的主要活性物質(zhì)是胡黃連苷[11]。很多研究表明，胡黃連苷已從胡黃連中被分離得到，為探究抗肝細(xì)胞毒性等生物活性成分提供了理論基礎(chǔ),也為中藥標(biāo)準(zhǔn)化提供了科學(xué)依據(jù)[12]。

胡黃連苷屬于萜類(lèi)化合物，萜類(lèi)化合物(Terpenoid)是一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，普遍存在于高等植物中。目前，已知的萜類(lèi)化合物已超過(guò)20 000種，高等植物中的萜類(lèi)物質(zhì)是揮發(fā)油、香料、甾醇和萜類(lèi)植保素的主要組成成分，有重要的藥用價(jià)值[13-19]。胡黃連苷中的環(huán)烯醚萜部分的合成依賴(lài)于前體物質(zhì)GPP(香葉基焦磷酸)，而GPP的C10骨架由 IPP(異戊烯基焦磷酸)及其異構(gòu)體 DMAPP(二甲基烯丙基焦磷酸)頭尾縮合而成，這一反應(yīng)由GPPS(香葉基焦磷酸合酶)催化[20]。所以，GPPS在胡黃連苷的形成過(guò)程中有重要作用。

目前，已從多種植物中克隆得到GPPS基因。不同的高等植物中，GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)域保守區(qū)均表現(xiàn)出很高的相似性[21-23]。雖然胡黃連化學(xué)成分方面的研究相對(duì)較多，并取得了顯著成果，但胡黃連萜類(lèi)化合物合成的調(diào)控研究比較少。本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)里得到主產(chǎn)于印度的胡黃連GPPS基因的全長(zhǎng) cDNA 序列，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)其序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能進(jìn)行分析，為揭示胡黃連中胡黃連苷等活性成分的調(diào)控機(jī)制和代謝途徑奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步提高胡黃連中胡黃連苷等萜類(lèi)化合物的含量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

本研究利用的胡黃連GPPS基因數(shù)據(jù)來(lái)源于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，GenBank登錄號(hào)為AY866498。

1.2 方法

1.2.1 胡黃連GPPS基因的序列分析 利用在線程序Blast和Blastp從核苷酸和氨基酸水平分析GPPS基因及其編碼氨基酸序列，利用DNAMAN對(duì)胡黃連GPPS蛋白序列與其他高等植物中的GPPS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6構(gòu)建各個(gè)物種的GPPS同源序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 胡黃連GPPS蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用DNAMAN對(duì)胡黃連GPPS蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等進(jìn)行分析，利用TMHMM在線分析胡黃連GPPS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域，利用ExPASy SignalP 4.0 Serve分析胡黃連GPPS蛋白信號(hào)肽，利用WoLFPSORT在線定位預(yù)測(cè)胡黃連GPPS蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，利用ExPASy ProtScale分析胡黃連GPPS蛋白疏水性。

1.2.3 胡黃連GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及結(jié)構(gòu)域分析 利用SOPMA對(duì)胡黃連GPPS蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，采用Swiss-model同源建模方法對(duì)胡黃連GPPS蛋白進(jìn)行在線3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，利用NCBI的CDD(Conserved domain database)數(shù)據(jù)庫(kù)和Inter ProScan對(duì)胡黃連GPPS蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行在線分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡黃連GPPS基因序列分析

分析結(jié)果表明，胡黃連GPPScDNA全長(zhǎng)1 381 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)在基因序列上的區(qū)域?yàn)榈?14—1 229個(gè)核苷酸，開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)1 116 bp，編碼371個(gè)氨基酸(圖1)，相對(duì)分子質(zhì)量為40 384.1，等電點(diǎn)為5.28。氨基酸種類(lèi)組成中(圖2)亮氨酸(Leu)和丙氨酸(Ala)的含量最多；而組氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)以及色氨酸(Trp)的含量則相對(duì)較少。

由表1可知，經(jīng)比對(duì)分析獲得序列相似度較高的20條不同物種中的氨基酸序列。其中，胡黃連GPPS氨基酸序列與小花茉莉GPPS氨基酸序列相似性高達(dá)77%。利用DNAMAN軟件將胡黃連GPPS氨基酸序列與其中相似性較高的9條GPPS氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果表明，胡黃連中的GPPS蛋白和其他物種中GPPS蛋白在保守區(qū)結(jié)構(gòu)域上相似度很高(圖3)。

系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖4)表明，20個(gè)物種中的GPPS氨基酸序列聚合成2個(gè)分支：茶樹(shù)、三七、胡楊、歐榛、啤酒花、金絲小棗、紫花苜蓿形成一個(gè)分支，其與胡黃連GPPS親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；胡黃連、米團(tuán)花、野甘草、芝麻、金魚(yú)草、小花茉莉、長(zhǎng)春花、中?？Х?、北野菊、案頭菊、牽?；?、甘薯形成另外一個(gè)分支。其中，胡黃連和金魚(yú)草、小花茉莉等親緣關(guān)系相對(duì)較近，植物形態(tài)學(xué)分類(lèi)結(jié)果表明，其同為玄參科植物，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)植物分類(lèi)結(jié)果相似。

圖1 胡黃連GPPS的cDNA序列及預(yù)測(cè)的編碼蛋白的氨基酸序列

圖2 胡黃連GPPS蛋白的氨基酸組成

表1 胡黃連GPPS氨基酸序列與NCBI中已知植物GPPS序列比對(duì)結(jié)果%

圖3 胡黃連GPPS與近緣物種GPPS蛋白的多序列比對(duì)

圖4 胡黃連近緣物種的GPPS系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

2.2 胡黃連GPPS 蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白疏水性分析結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白屬于親水蛋白(圖5)。胡黃連GPPS蛋白的跨膜區(qū)域在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白不存在跨膜區(qū)，屬于膜外在蛋白(圖6)。

圖5 胡黃連GPPS蛋白疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果

圖6 胡黃連GPPS蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

胡黃連GPPS蛋白信號(hào)肽分析未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，所以胡黃連GPPS蛋白為非分泌蛋白(圖7)；胡黃連GPPS蛋白亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白定位于葉綠體的可能性最高，定位系數(shù)為6。

圖7 胡黃連GPPS蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3 胡黃連GPPS蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白主要由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成(圖8)，其中α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲的比例較高，分別為47.71%和29.92%，延伸鏈占13.21%，β轉(zhuǎn)角占9.16%。

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，胡黃連GPPS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，其次是無(wú)規(guī)卷曲，延伸鏈和β轉(zhuǎn)角所占比例很少(圖9)。胡黃連GPPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致，推測(cè)胡黃連GPPS蛋白為α螺旋型蛋白。

圖8 胡黃連GPPS二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖9 胡黃連GPPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其保守結(jié)構(gòu)域主要為聚丙烯合成酶結(jié)構(gòu)域(Polyprenyl synthetase)(IPR000092)，位于107—341位(PF00348)；萜類(lèi)合成酶結(jié)構(gòu)域(Isoprenoid synthase domain)(IPR008949)，分別位于80—352位(SSF48576)和77—369位(1.10.600.10)；聚丙烯相關(guān)合成酶結(jié)構(gòu)域(Polyprenyl synthetase conserved site)(IPR033749)，分別位于156—172位(PS00723)和289—301位(PS00444)；另外，還有GPPS結(jié)構(gòu)域，在 IPR 中沒(méi)有明確分類(lèi)，位于1—371位(PTHR43281)(圖10)。檢索 NCBI 的 CDD數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，胡黃連GPPS蛋白為類(lèi)異戊二烯合酶超家族成員(圖11)，其功能與萜類(lèi)物質(zhì)的合成十分密切。

圖10 Inter ProScan預(yù)測(cè)的胡黃連GPPS蛋白保守結(jié)構(gòu)域

圖11 CDD預(yù)測(cè)胡黃連GPPS蛋白結(jié)構(gòu)域

3 結(jié)論與討論

胡黃連苷是中藥胡黃連中的主要藥用成分，通過(guò)對(duì)胡黃連苷生物合成途徑的研究發(fā)現(xiàn)，胡黃連苷萜類(lèi)成分的生物合成屬M(fèi)EP途徑，其中IPP和DMAPP 2種異構(gòu)體頭尾縮合結(jié)合為GPP，是 MEP 途徑的重要步驟，催化該反應(yīng)進(jìn)行的就是GPPS。隨著B(niǎo)urke等[24]第一次得到了GPPS基因全長(zhǎng)cDNA序列后，相繼從擬南芥[25]、金魚(yú)草[26]等植物中也克隆得到了GPPS基因。截至目前，僅在少數(shù)植物中對(duì)GPPS的活性進(jìn)行了研究，且在產(chǎn)生大量單萜的組織中才存在GPPS蛋白，因此純化比較困難[27]，對(duì)GPPS的研究主要集中在其對(duì)單萜和倍半萜的影響，如Rai等[28]從長(zhǎng)春花中克隆到CrGPPS基因，發(fā)現(xiàn)CrGPPS蛋白質(zhì)在長(zhǎng)春花中以雜聚肽和同聚肽2種形式存在，且發(fā)現(xiàn)只有含有GrGPPS.SSU的雜聚肽GPPS能調(diào)控單萜吲哚生物堿生物合成中的 GPP 流；Chang等[29]研究發(fā)現(xiàn)，辣薄荷中的MpGPPS包含2個(gè)具有催化功能的大亞基和2個(gè)非催化的具有調(diào)控功能的小亞基，并且證實(shí)與薄荷醇的生物合成有關(guān)。

胡黃連GPPS的cDNA全長(zhǎng)1 381 bp，其編碼的蛋白序列含有371個(gè)氨基酸殘基；亞細(xì)胞定位在葉綠體中發(fā)揮其生物功能，疏水性分析表明，胡黃連GPPS為親水性蛋白，在氨基酸序列中具有2個(gè)較強(qiáng)的親水區(qū)域，不含有信號(hào)肽序列，表明胡黃連GPPS為非分泌蛋白，這與薄荷GPPS基因、滇龍膽GPPS基因的研究結(jié)果一致[22-23]。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，胡黃連與小花茉莉、金魚(yú)草的親緣關(guān)系比較近，分別為77%和74%。此外，本研究也表明，GPPS基因在不同物種中無(wú)論cDNA序列長(zhǎng)度、編碼的氨基酸殘基數(shù)還是保守結(jié)構(gòu)域都有較大的相似性。GPPS基因的保守結(jié)構(gòu)域主要是由聚丙烯合酶結(jié)構(gòu)域、萜烯合成酶結(jié)構(gòu)域和GPPS結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。使用DNAMAN軟件，將胡黃連與其他高等植物中的GPPS氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GPPS氨基酸序列在不同物種中存在多個(gè)相似的保守結(jié)構(gòu)域，與前人對(duì)其他物種GPPS的序列分析結(jié)果相似[22-23]，進(jìn)一步證明了胡黃連GPPS蛋白為異戊二烯合酶超家族成員。采用生物技術(shù)來(lái)緩解資源短缺等問(wèn)題是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的目的之一，本研究將為從分子水平揭示胡黃連中胡黃連苷等活性成分的調(diào)控機(jī)制和代謝途徑奠定基礎(chǔ)，為發(fā)現(xiàn)新的萜類(lèi)合成途徑和深入研究植物萜類(lèi)合成途徑各組分功能提供了參考，也為單萜化合物的生物工程提供了候選基因。