蘇 可，劉艷玲，姜軍坡*，王世英*，梁亞男

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001； 2.保定市徐水區(qū)農(nóng)業(yè)局，河北 保定 072550)

在獺兔集約化、規(guī)模化的養(yǎng)殖中，由大腸桿菌等病原菌引起的傳染性腹瀉常發(fā)生于仔幼兔群，其具有傳染速度快、死亡率高、難治愈的特點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了仔幼兔的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。為了避免仔幼兔腹瀉導(dǎo)致的大量死亡及經(jīng)濟(jì)損失，養(yǎng)殖戶一般采用在飼料中加入抗生素的方法來(lái)防治，但長(zhǎng)期使用抗生素會(huì)造成耐藥菌產(chǎn)生[3-4]、腸道微生態(tài)破壞[5]及畜產(chǎn)品藥物殘留[6]等，直接或間接危害著人類的健康。微生態(tài)制劑作為合適的抗生素替代品具有無(wú)毒、無(wú)污染、無(wú)副作用、無(wú)殘留的特性，且成本較低，防治效果好[7-9]。Tu-1菌株是以大腸桿菌的拮抗活性為主要篩選指標(biāo)，從健康兔盲腸中分離得到的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[10]。本試驗(yàn)將Tu-1菌劑和預(yù)防劑量的硫酸黏桿菌素分別添加至斷奶獺兔飼料中，研究它們對(duì)獺兔腸道酶活力、盲腸菌群、生長(zhǎng)性能及腹瀉的影響，為Tu-1菌劑替代抗生素飼料添加劑在養(yǎng)兔業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌劑

Tu-1微生物飼料添加劑由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)研制、河北眾邦生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。其以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)Tu-1菌株發(fā)酵制備，活菌(芽孢)含量1.0×1010cfu/g，以下簡(jiǎn)稱Tu-1菌劑。

1.2 培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基：按照GB/T 4789.2—2010配制，用于分離、計(jì)數(shù)細(xì)菌。EMB培養(yǎng)基：按照GB 4789.38—2012配制，用于鑒別、計(jì)數(shù)大腸桿菌。MRS培養(yǎng)基：按照GB/T4789.35—2010配制，用于鑒別、計(jì)數(shù)乳酸桿菌。BBL瓊脂培養(yǎng)基：按照GB/T4789.34—2012配制，用于分離、鑒別、計(jì)數(shù)雙歧桿菌。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼養(yǎng)管理

根據(jù)生長(zhǎng)狀況相似、公母各半的原則，選取60只40日齡健康斷奶獺兔，隨機(jī)分為對(duì)照組、抗生素組和菌劑組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只(公母各半)，分養(yǎng)于獺兔養(yǎng)殖籠內(nèi)。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料；抗生素組飼喂添加20 mg/kg硫酸黏桿菌素制成的含抗生素的基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料；菌劑組飼喂添加1.0‰Tu-1菌劑制成的含微生物飼料添加劑的基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料?；A(chǔ)全價(jià)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。預(yù)試期5 d，正試期30 d。于正試期開(kāi)始前和結(jié)束后對(duì)每只獺兔空腹稱始、末體質(zhì)量，并結(jié)算各組剩余飼料。每天觀察記錄獺兔腹瀉情況，計(jì)算各組獺兔腹瀉率。腹瀉率=∑(腹瀉兔數(shù)×兔腹瀉天數(shù))/(試驗(yàn)兔數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))×100%。

兔舍自然通風(fēng)，每天早、晚定時(shí)定量喂料2次，每次投喂量約50 g/只，試兔自由采食和飲水。每天打掃兔舍，保持干凈衛(wèi)生的飼養(yǎng)環(huán)境，并按照獺兔飼養(yǎng)要求統(tǒng)一免疫和驅(qū)蟲。飼養(yǎng)試驗(yàn)在河北省保定市大莊獺兔養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)全價(jià)顆粒飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 樣品采集

試驗(yàn)期結(jié)束后，每組隨機(jī)選取10只獺兔屠宰，解剖分離得十二指腸、空腸、回腸、盲腸內(nèi)容物，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定盲腸內(nèi)容物10倍稀釋液的pH值[11]。其余立即放入滅菌后的離心管中，置于液氮中冷凍，帶回河北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室放入-20 ℃冰箱中備測(cè)。

1.5 各腸段消化酶活力測(cè)定

待測(cè)樣品的制備：稱取腸段內(nèi)容物各0.5 g，加2.0 mL蒸餾水，8 000 r/min離心取上清液，即為5倍稀釋的待測(cè)酶液。

采用GB/T 28715—2012、GB/T 2440—2009、NY/T 912—2004和GB/T 23535—2009所示的方法分別測(cè)定待測(cè)酶液的酸性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶活力。

1.6 盲腸菌群數(shù)量測(cè)定

取盲腸內(nèi)容物，用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7。選擇3個(gè)適當(dāng)稀釋度溶液各0.1 mL分別涂布PCA、EMB、MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板，每種平板每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)。PCA和EMB平板在36 ℃培養(yǎng)48 h，MRS和BBL瓊脂培養(yǎng)基平板需在36 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。選擇30～300 cfu/皿的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果以lg (cfu/g)表示。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，LSD法進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu-1菌劑對(duì)獺兔腸道消化酶活力及pH值的影響

由表2可知，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸蛋白酶活力比對(duì)照組分別提高13.05%、17.95%、21.27%和31.58%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸淀粉酶活力比對(duì)照組分別提高13.93%、14.23%、45.51%和49.58%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸脂肪酶活力比對(duì)照組分別提高11.71%、18.17%、19.22%和26.84%(P<0.05)，菌劑組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對(duì)照組分別提高69.84%、83.43%、111.06%和54.59%(P<0.01)；抗生素組的十二指腸、空腸、回腸和盲腸纖維素酶活力比對(duì)照組降低了16.67%、28.57%、12.90%和23.41%(P<0.05)，其他3種酶活力與對(duì)照組基本一致。

菌劑組盲腸的pH值比對(duì)照組降低0.72(P<0.05)，其他各腸段的pH值也略低于對(duì)照組(P>0.05)；抗生素組各腸段pH值與對(duì)照組相比無(wú)顯著變化。

2.2 Tu-1菌劑對(duì)獺兔盲腸菌群的影響

由表3的數(shù)據(jù)可知，菌劑組盲腸中大腸桿菌的數(shù)量比對(duì)照組極顯著降低(P<0.01)，而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量均比對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，細(xì)菌總數(shù)變化不顯著；抗生素組盲腸中大腸桿菌和細(xì)菌總數(shù)均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，而乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量比對(duì)照組略低(P>0.05)。

表2 Tu-1菌劑對(duì)獺兔腸道消化酶活力及pH值的影響

注：同列相同腸段不同小寫字母上標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母上標(biāo)表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

表3 Tu-1菌劑對(duì)獺兔盲腸菌群數(shù)量的影響

2.3 Tu-1菌劑對(duì)獺兔生長(zhǎng)性能及腹瀉率的影響

表4的結(jié)果表明，菌劑組和抗生素組的日增體質(zhì)量比對(duì)照組分別提高16.61%和13.74%(P<0.05)；菌劑組的料重比、腹瀉率與對(duì)照組相比分別降低了9.51%、68.11%(P<0.05)，抗生素組的料重比、腹瀉率比對(duì)照組分別降低了8.29%、64.03%(P<0.05)，且菌劑組和抗生素組之間無(wú)顯著差異。

表4 Tu-1菌劑對(duì)獺兔生長(zhǎng)性能及腹瀉率的影響

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Tu-1菌劑能夠顯著提高獺兔腸道消化酶活力，抑制盲腸大腸桿菌，促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益菌的生長(zhǎng)；硫酸黏桿菌素對(duì)腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力沒(méi)有影響，顯著降低獺兔腸道纖維素酶活力，硫酸黏桿菌素顯著降低盲腸中大腸桿菌數(shù)量和細(xì)菌總數(shù)，對(duì)乳酸桿菌、雙歧桿菌無(wú)明顯抑制作用。Tu-1菌劑在提高獺兔日增體質(zhì)量，降低料重比和腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素，但二者無(wú)顯著差異。因此，Tu-1菌劑在提高獺兔生產(chǎn)性能和腸道消化酶活力，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡和降低腹瀉率方面優(yōu)于硫酸黏桿菌素。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，Tu-1菌劑和硫酸黏桿菌素均能顯著提高獺兔生長(zhǎng)性能并顯著降低腹瀉率，但二者對(duì)腸道消化酶和盲腸菌群的影響有明顯不同，這提示二者的作用機(jī)制可能不同。Tu-1菌劑進(jìn)入獺兔腸道后，經(jīng)自身生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生或促進(jìn)腸道產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等各種消化酶，提高飼料各種主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)附著位點(diǎn)、生物奪氧、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等方式抑制病原菌生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)維護(hù)腸道微生態(tài)[12-13]；而硫酸黏桿菌素則是通過(guò)改變腸壁組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，殺滅包括病原菌在內(nèi)的部分腸道微生物，降低微生物對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)起到促生長(zhǎng)的作用[14]。

顧雅君等[15]在Tu-1菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步分離篩選得到Tu-2菌株，制備了Tu-2制劑，并將Tu-2制劑添加至飼料中，研究其對(duì)肉兔糞便消化酶活性和生長(zhǎng)性能的影響，結(jié)果表明，添加該制劑后肉兔糞便中纖維素酶、蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的平均活力比對(duì)照組分別提高36.65%、31.81%、20.99%和23.08%，平均增體質(zhì)量提高16.40%，料重比降低l4.15%。這與本試驗(yàn)中Tu-1菌劑顯著提高獺兔各腸段消化酶的活力，顯著提高獺兔生長(zhǎng)性能的試驗(yàn)結(jié)果相一致。本試驗(yàn)中，Tu-1菌劑可顯著降低獺兔盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，主要是因?yàn)門u-1菌株是利用大腸桿菌的拮抗性為主要篩選指標(biāo)從健康獺兔盲腸中分離得到的芽孢桿菌[10]，而乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量比對(duì)照組均顯著提高，可能是由于Tu-1菌劑進(jìn)入腸道后，利用腸道內(nèi)環(huán)境進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，消耗腸道內(nèi)過(guò)多氧氣，制造厭氧環(huán)境，促進(jìn)厭氧菌生長(zhǎng)的緣故[16-17]。硫酸黏桿菌素使盲腸中大腸桿菌和細(xì)菌總數(shù)極顯著低于對(duì)照組，而對(duì)乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量基本無(wú)影響，其原因是硫酸黏桿菌素主要?dú)缒c道中敏感的革蘭氏陰性菌[18-19]，對(duì)乳酸桿菌和雙歧桿菌等革蘭氏陽(yáng)性菌幾乎無(wú)作用。

本試驗(yàn)測(cè)得對(duì)照組獺兔(75日齡)各腸段的pH值變化規(guī)律為回腸>空腸>十二指腸>盲腸，這與高振華等[20]研究獺兔消化道pH值的變化規(guī)律得到的結(jié)果一致。與對(duì)照組相比，Tu-1菌劑能夠顯著降低盲腸內(nèi)容物的pH值，這可能是因?yàn)樵摼暝诿つc中產(chǎn)生了較多纖維素酶，分解纖維素產(chǎn)生葡萄糖等小分子糖類后又被微生物利用產(chǎn)生較多的有機(jī)酸所致。但在腸道的前段菌株尚未充分生長(zhǎng)繁殖，影響較小，因此十二指腸、空腸、回腸的pH值只是稍有下降，未達(dá)到顯著水平。