汪 磊,趙寶磊,馮 華,劉運超,魏 薔,張改平*

(1.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002； 2.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/農業(yè)部動物免疫學重點實驗室,河南 鄭州 450002)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV),屬于圓環(huán)病毒科(Circoviride)圓環(huán)病毒屬,是一種無囊膜的單股環(huán)狀負鏈DNA病毒,是目前發(fā)現的最小的動物病毒之一[1]。豬圓環(huán)病毒是世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病源之一,分為圓環(huán)病毒1型(PCV1)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)。PCV2具有致病性,是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,感染該病毒后可導致豬群產生免疫抑制,造成與其他病毒如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)等病原的并發(fā)混合感染加重病情,使疾病診斷和治療更困難[2],給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的損失。

PCV病毒基因組全長 1 766～1 768 bp,PCV2含11個開放的閱讀框(Open reading fame,ORF),其中ORF1、ORF2是2個重要的開放閱讀框。ORF1全長904 bp，主要編碼與病毒復制有關的蛋白質(Replication associated protein,Rep)。ORF2全長702 bp或705 bp,主要編碼病毒衣殼蛋白(Capsid protein,Cap),Cap蛋白是病毒的結構蛋白,60個Cap蛋白組成病毒的衣殼。此外,Cap蛋白也是PCV2主要的靶抗原,具有較強免疫原性,能夠誘導機體產生中和抗體,是目前豬圓環(huán)病毒新型診斷技術與基因工程疫苗研發(fā)的重要抗原,也是PCV2型疫苗研究的熱點[3]。有研究表明,PCV1和PCV2的ORF1基因比較保守,同源性高達85%,氨基酸同源性在86%以上,兩者之間的變異較小,2種病毒之間存在交叉反應；但是PCV1和PCV2的ORF2基因同源性只有66%,氨基酸同源性僅為64%,變異較大,因此可以利用ORF2的序列對PCV的亞型進行鑒定[4]。目前,PCV2主要分為PCV2a、PCV2b、PCV2c 3個基因亞型,通過對PCV2分子流行病學和遺傳變異的研究,PCV2a主要集中于2003年之前在世界各地暴發(fā)感染,但2003年PCV2b成為主要流行的基因型[5-6]。

本研究從河南省不同地區(qū)豬場的疑似PMWS病料組織中分離出PCV2毒株,采用PCR方法檢測鑒定,并通過生物信息學軟件分析該毒株的遺傳進化,旨在分析河南地區(qū)PCV亞型和基因突變趨勢,為疫病防控和疫苗研究提供指導。

1 材料和方法

1.1 材料

疑似PMWS的病料(河南省不同地區(qū)豬場采集的淋巴結、肺臟、肝臟等)、無PCV污染的PK-15細胞、PCV2鼠源單抗6A5和pMD18-T載體由河南省農科院動物免疫學重點實驗室保存；DH5α感受態(tài)細胞、瓊脂糖等購自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、無支原體胎牛血清(FBS)購自索萊寶公司；AEC顯色試劑盒、病毒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和質?？焖偬崛≡噭┖匈徸蕴旄?；T4 DNA連接酶、Premix ExTaqDNA聚合酶、DNA Marker購自TAKARA公司；HRP標記羊抗鼠IgG購自于北京博奧森有限公司。

1.2 DNA提取

將收集到的淋巴結、肺臟和肝臟等病料組織在無菌條件下剪碎,用含有雙抗的PBS液進行充分研磨,制成20%～50%懸液并裝入凍存管內,放入-80 ℃冰箱反復凍融3次,取出后用8 000 r/min轉速離心10 min,取上清進行分裝,每管200 μL,-80 ℃保存?zhèn)溆?。取分裝的上清液200 μL,加入4 μL蛋白酶K和200 μL蛋白裂解液并混合均勻,放入56 ℃水浴2.5 h,提取DNA后用30 μL無菌水溶解,放于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中PCV2b的基因組序列,利用Oligo 6.0設計2對引物P1/P2和P3/P4(表1),并由上海生工生物工程有限公司合成。合成P1/P2主要用來擴增PCV2的Cap端基因序列和病料中PCV2的PCR檢測,P3/P4主要用來擴增PCV2的非Cap端基因序列,兩者擴增的片段拼接即可得到全長片段。

表1 PCV2的PCR檢測引物和全基因組擴增引物

1.4 病毒PCV2的檢測

用P1/P2引物對提取的DNA進行PCR擴增,即特異性PCR鑒定。PCR反應體系20 μL：ExTaqDNA聚合酶10 μL,上下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,滅菌超純水6 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共32次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。以超純水代替模板設置陰性對照。反應結束后,PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCV2分離與鑒定

1.5.1 PCV2的分離 將檢測為陽性的病料上清液200 μL用滅菌的0.22 μm濾器過濾,經氯仿室溫處理10 min后,接種PK-15細胞；37 ℃培養(yǎng)1 h后,棄掉培養(yǎng)基,用PBS洗滌細胞3次,加入細胞維持液放于37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)60 h,反復凍融3次后12 000 r/min離心10 min收獲病毒,之后接種到PK-15細胞,按上述操作進行傳代。針對每一代收獲的細胞都以P1/P2 為引物,以PCV2為陽性對照，同時設立未接毒的PK-15細胞為陰性對照,進行PCR檢測。

1.5.2 PCV2的鑒定 將收獲的病毒用單層過氧化物酶試驗(IPMA)進行鑒定。將病毒接種到在96孔細胞板上培養(yǎng)的PK-15細胞,37 ℃培養(yǎng)48～60 h；棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌3次,晾干；用冰乙醇于-20 ℃下固定細胞30 min,用PBS洗滌3次,晾干；用 0.2% Tritonx-100/PBS和3% H2O2的混合液,37 ℃孵育10 min,PBS洗滌3次,晾干；加封閉液37 ℃封閉1 h,PBS洗滌3次,晾干；加入鼠源PCV2單抗6A5(1∶500)每孔50 μL,37 ℃孵育45 min,PBS洗滌5次,晾干；加入HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶1 000)每孔50 μL,37 ℃孵育40 min,用PBS洗滌5次,晾干；AEC顯色10 min,PBS洗滌3次,晾干；80%甘油封底,顯微鏡下觀察。

1.6 PCV2基因組擴增及同源性分析

1.6.1 特異性PCR鑒定 將1.5中收獲的病毒提取DNA,分別用引物P1/P2和P3/P4進行PCR擴增。反應結束后,PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6.2 PCR產物的連接及轉化 通過膠回收試劑盒回收目的DNA片段,用T4 DNA連接酶將回收產物與pMD18-T載體連接,構建重組質粒。10 μL連接體系如下：純化的DNA片段3 μL,T4 DNA連接酶2 μL,pMD18-T載體1 μL,T4 DNA連接酶緩沖液4 μL。放于4 ℃連接槽中連接24 h。將10 μL連接產物加入40 μL DH5α感受態(tài)細胞中,混合均勻后冰浴30 min；放入42 ℃水浴進行熱激60 s,之后立即放到冰水中3 min；在超凈工作臺內加入950 μL無菌LB液體培養(yǎng)基,放于37 ℃搖床溫和振蕩1 h；3 000 r/min離心5 min；棄去900 μL上清后重新懸??；小心將懸浮液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基(AMP+)上,將涂好的平皿倒置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h。

1.6.3 重組質粒的鑒定與PCV2基因組序列分析 篩選出陽性菌落擴大培養(yǎng)并提取質粒,利用PCR對重組質粒進行擴增,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR反應體系和程序按照1.4中的方法設置,將擴增結果為陽性的質粒送上海生工生物工程有限公司測序,采用MegAlign軟件對測序結果與GenBank上的PCV2基因組全長進行比對分析,并構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 病料PCV2的檢測

處理病料的上清液經過DNA提取、PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果表明，在11份疑似PMWS患豬的病料組織中,可以擴出目的片段為702 bp的PCV2特異性條帶的組織樣品總共有7份(圖1),PCV2檢出率為63.6%。

M：DNA Marker DL2000；1—11：不同病料提取DNA的PCR擴增產物；N：陰性對照圖1 病料組織中PCV2的PCR擴增

2.2 PCV2的分離培養(yǎng)

從檢測結果為陽性的7份組織病料中篩選出陽性值較高的第9號病料,研磨后離心得到上清液,將其接種到PK-15細胞上,并連續(xù)傳代。用引物P1/P2檢測收獲的每一代細胞,均能擴出特異性PCV2條帶(圖2),說明分離到的PCV2能夠在PK-15細胞上增殖,將其命名為zmd-20161022。

M：DNA Marker DL2000；1—11：每一代細胞中PCV2的PCR擴增產物；N：陰性對照；P：陽性對照圖2 每一代細胞中PCV2的PCR擴增

2.3 PCV2的IPMA鑒定

將擴增至第11代的PCV2接種于96孔板上的PK-15細胞,37 ℃ 培養(yǎng)60 h后,利用IPMA進行檢測(圖3),在接種PCV2的PK-15細胞中均能出現特異性紅色染色(A),陰性對照的細胞上沒有出現特異性染色(B)。

A：感染PCV2的PK-15細胞；B：未感染的PK-15細胞對照圖3 IPMA檢測感染PCV2的PK-15細胞

2.4 PCV2基因序列擴增及重組質粒的鑒定

對收獲的病毒進行DNA的提取,利用引物P1/P2和P3/P4分別進行PCR擴增,電泳結果顯示在702 bp和1 067 bp左右的位置出現目的電泳條帶(圖4),對獲得的重組質粒進行PCR擴增和電泳檢測,結果顯示,擴增結果與預期的結果相一致。

2.5 PCV2分離株基因序列測定與分析

采用MegAlign軟件對測序結果進行拼接,Cap段和非Cap端的序列拼接得到全基因組序列,該毒株序列全長為1 767 bp。與GenBank上的PCV2基因組全長進行比對,發(fā)現分離得到的zmd-20161022毒株PCV2核苷酸序列與PCV1(AY184287)同源性為76.8%,與國內報道的PMWS相關PCV2(AF381175)同源性為95.2%,與國內3株PCV2商品苗毒株(AY686763、HM641752、HM038034)同源性為95.2%～98.3%。與加拿大報道的第一例引起PMWS的PCV2(AF027217)同源性為95.3%,與基因登錄號為HM038030.1的同源性最高為98.6%(圖5)。其中對分離株PCV2的ORF2片段序列進行進化樹分析發(fā)現,zmd-20161022毒株ORF2序列與HM038030.1的同源性最高,被鑒定為PCV2b-1c型,屬于PCV2b的一種亞型(圖6)。

M：DNA Marker DL2000；1：引物P3/P4擴增PCV2；2：引物P1/P2擴增PCV2；N：陰性對照圖4 PCV2的PCR擴增結果

圖5 PCV2分離株全基因組核苷酸序列比較

圖6 PCV2分離株ORF2核苷酸序列的系統(tǒng)進化樹

3 結論與討論

近來年,PCV2在世界范圍內傳播,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失,我國是一個養(yǎng)豬大國,因而對該病的研究具有重要的意義。本研究從河南省的不同地區(qū)豬場采集了11份疑似PMWS患豬的病料組織,通過對病料進行病毒的分離鑒定,結果顯示PCV2陽性的樣品有7份,PCV2檢出率為63.6%。由于PMWS常由PCV2和其他病毒共同感染引起[7],例如CSFV、PRRSV、PRV等豬類易感病毒,所以采集到病料可能含有除PCV2以外的病毒。在接種PK-15細胞前使用氯仿對組織研磨液進行處理,目的就是清除PRRSV、CSFV、PRV等含有囊膜的病毒[8]。由于PCV2的增殖主要借助于細胞分裂期S期所產生的蛋白質,因此可以將PCV2與PK-15細胞同步接種,這樣當PK-15細胞進入分裂期的S期,可以給PCV2的增殖提供更多可以促進PCV2復制的多聚酶[9]。從檢測結果為陽性的病料中挑選陽性值較高的zmd-20161022接種到PK-15細胞上進行分離培養(yǎng),并采用PCR和IPMA鑒定分離的毒株,結果顯示,分離的毒株能夠與保存的豬陽性血清發(fā)生特異性反應,說明分離的毒株具有制作滅活疫苗的潛力。

近年來國內外報道,PCV2的流行株逐漸變得復雜化、多元化[10],因此,養(yǎng)殖場可以根據當地 PCV2 流行情況,有針對性地選擇疫苗。有研究對2001—2009年全國各地區(qū)分離到的136份PCV2進行遺傳進化分析,在2001—2005年分離得到的PCV2中,PCV2a基因型占92%,但是從2005—2009年分離得到的PCV2基因型中,PCV2b型占有很大比例。董林等[11]研究表明，從2005年以后我國豬圓環(huán)病毒主要流行株已經由PCV2a逐漸轉變?yōu)镻CV2b,PCV2b是近年來國內流行株的優(yōu)勢基因型。有學者對2011—2012年我國華北地區(qū)PCV2進行序列分析發(fā)現,PCV2的變異趨勢是從PCV2a到PCV2b-1c[12-13]。同時對2005—2011年河南地區(qū)PCV2流行情況的研究證實,PCV2b在河南省屬于流行毒株[14]。PCV2基因組中堿基的缺失和替換對于病毒的進化也是非常重要的,由于 ORF2基因在各個亞型中的同源性相對較低,存在不同的變異,因此研究人員常常通過對ORF2進行分析來了解PCV2的流行病學[15]。同時ORF2 基因編碼含有免疫原性的病毒結構蛋白(Cap),可自我裝配病毒樣顆粒,并含有病毒中和抗原表位區(qū)域,已成為PCV2疫苗研發(fā)的主要候選基因之一。

本研究從疑似PMWS病料中分離得到PCV2毒株,通過全基因組測序和對ORF2序列分析得知所分離的zmd-20161022毒株屬于PCV2b的一種亞型PCV2b-1c型,證明該亞型毒株已成為河南省主要流行株；此外,通過研究分離毒株的遺傳變異特征,為河南省PCV2的診斷、防控和疫苗的研發(fā)奠定了良好的基礎。