郝風(fēng)聲，李麗華，王 靜，姚 欣，石永春，趙佳佳，郭紅祥，劉衛(wèi)群*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所，河南 鄭州 450002； 3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002； 4.河南省煙草公司 駐馬店市公司，河南 駐馬店463000)

煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV) 是對(duì)農(nóng)作物危害最嚴(yán)重的病毒[1]，在世界各地均有分布，能侵染茄科、葫蘆科、十字花科等重要作物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了很大的經(jīng)濟(jì)損失。自1886年Mayer[2]首次發(fā)現(xiàn)TMV，并證實(shí)感染病株的汁液有傳染性以來(lái)，科學(xué)工作者通過(guò)篩選化學(xué)[3]和生物制劑[4]防治TMV侵染，效果并不顯著，而采用生物工程技術(shù)防治[5]，又無(wú)法應(yīng)用于大田生產(chǎn)。由于TMV侵染寄主的方式復(fù)雜，并且植物沒(méi)有動(dòng)物那樣完整的免疫代謝系統(tǒng)，導(dǎo)致煙草花葉病的防治研究尚未達(dá)到理想效果。為了有效控制植物病毒病的危害，目前國(guó)內(nèi)外許多研究機(jī)構(gòu)正致力于植物病毒抑制物的篩選[6-8]，然而由于植物病毒長(zhǎng)期以來(lái)產(chǎn)生了抗藥性，同時(shí)很多研制的藥物成本較高，應(yīng)用范圍受到一定的限制。因此，改變研究策略，通過(guò)蛋白質(zhì)組技術(shù)來(lái)檢測(cè)TMV侵染煙草過(guò)程中關(guān)鍵差異蛋白質(zhì)的變化，以此篩選煙草抵抗TMV侵染的位點(diǎn)，有針對(duì)性地采用藥物防治，將減緩TMV對(duì)煙草的危害。

TMV作為專性的胞內(nèi)寄生物，與寄主細(xì)胞環(huán)境關(guān)系非常密切并完全依賴寄主細(xì)胞環(huán)境，這種依賴性需要病毒蛋白質(zhì)和核酸轉(zhuǎn)換寄主因子的正常功能[7]。目前，采用相關(guān)學(xué)科互相滲透和結(jié)合的技術(shù)揭示了與病毒侵染相關(guān)的寄主蛋白質(zhì)、核酸以及這些因子在病毒致病性中的作用[9-10]。本研究通過(guò)采用iTRAQ技術(shù)檢測(cè)蛋白質(zhì)組的變化，研究TMV侵染不同時(shí)間段對(duì)寄主代謝過(guò)程的影響，篩選出光合系統(tǒng)和葉綠素代謝中的重要差異蛋白質(zhì)，以增強(qiáng)其活性為目標(biāo)，采用不同的制劑處理，監(jiān)測(cè)TMV侵染對(duì)這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)基因的影響，并采用半葉枯斑試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期開發(fā)干擾病毒侵染的藥劑，為防治病毒病對(duì)農(nóng)作物的危害奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試材料：中煙100、珊西煙。

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；3%寧南霉素購(gòu)自廣州穗澤環(huán)?？萍加邢薰荆黄渌Ｒ?guī)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

制劑A：2.5 mmol/L海藻酸、2.6 mmol/L海藻糖、10 mmol/L NaOH；制劑B：3%鹽酸嗎啉胍、2.6 mmol/L海藻糖；寧南霉素：3%寧南霉素稀釋100倍。

1.2 病毒粗提液提取、接種與取樣

病毒粗提液提?。喝MV毒源(新鮮病葉)，清水沖洗干凈后用消毒濾紙吸干并去除主脈。根據(jù)取樣質(zhì)量加入40倍體積的磷酸緩沖液(0.05 mol/L， pH值7.0)，研磨后配制成40倍的病毒汁液，離心取上清液[11]備用。

接種病毒：選取移栽期30 d左右、長(zhǎng)勢(shì)一致的中煙100煙株，分別采用制劑A和B 進(jìn)行處理，每株噴施量為5 mL，以不噴施制劑為陰性對(duì)照(CK)，噴施寧南霉素為陽(yáng)性對(duì)照；24 h后，選取頂端新生葉下數(shù)第4片葉，表面均勻撒下金剛砂，用刷子蘸取1 mL的病毒汁液輕輕摩擦重復(fù)3次對(duì)煙株接種TMV。接種完成1 h后清水噴洗葉面，以利于植株發(fā)病[12-13]。

取樣：分別在接種病毒后0、12、24、36 h取接種葉片的上部葉，于-80 ℃保存。

1.3 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.1 蛋白質(zhì)樣品制備 (1)稱取保存的煙葉樣品約0.2 g，按煙葉質(zhì)量的10%加入PVP，用液氮充分研磨成粉末，將樣品粉末轉(zhuǎn)入2 mL離心管內(nèi)；(2)加入預(yù)冷的TCA-丙酮(10%TCA和100 mL丙酮)1 mL，-20 ℃靜置2 h沉淀蛋白質(zhì)， 4 ℃、20 000 g離心 30 min，棄上清，沉淀中加入預(yù)冷的丙酮清洗(將沉淀?yè)v碎或重懸)，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃、20 000 g離心30 min，此操作可進(jìn)行多次，直至沉淀洗至白色；(3)在沉淀中加入1.5 mL裂解液(8 mol/L 尿素、30 mmol/L HEPES、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT)，超聲 5 min 助溶(超聲條件：脈沖打開2 s、關(guān)閉3 s，功率180 W)；(4)超聲后，20 000 g 離心 30 min，取上清，加入DTT至終濃度 10 mmol/L，56 ℃水浴 1 h后迅速加入IAM至終濃度 55 mmol/L，暗室靜置 1 h；(5)加入4 倍體積的預(yù)冷丙酮，-20 ℃靜置沉淀 3 h 以上，4 ℃、20 000 g離心30 min，棄上清；(6)加入 300 μL的復(fù)溶緩沖液(50% TEAB、0.1% SDS)，超聲 3 min 助溶，4 ℃、20 000 g離心30 min，取上清；(7)用Bradford法測(cè)定總蛋白質(zhì)的濃度，-80 ℃保存用于后續(xù)iTRAQ試驗(yàn)。

1.3.2 iTRAQ分析 iTRAQ分析由武漢金開瑞公司完成。

1.4 基因表達(dá)分析

總RNA提取根據(jù)Trizol試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行，mRNA的反轉(zhuǎn)錄根據(jù)南京諾唯贊公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)選用煙草Actin為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)；每個(gè)反應(yīng)體系包含2 μL稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、12.5 μL 2×SYBR Premix ExTaqTMⅡ、0.5 μL正向和反向引物及9.5 μL Nuclease-free水；具體反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。結(jié)果分析采用 2-ΔΔCT法，其中CT是循環(huán)閾值，ΔCT是目的基因與看家基因的CT值的差值，ΔΔCT是不同時(shí)間處理與對(duì)照ΔCT值的差值。

表1 差異表達(dá)基因的qRT-PCR引物序列

1.5 制劑防治效果的半葉枯斑法驗(yàn)證

對(duì)珊西煙(10葉期)左半片葉噴施不同制劑1 mL，右半片葉不噴施，24 h后對(duì)全葉接種TMV[4]。每個(gè)處理接種3個(gè)葉片，5 d后觀察結(jié)果并計(jì)算枯斑抑制率?？莅咭种坡?(對(duì)照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù))/對(duì)照枯斑數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種TMV后不同時(shí)間光合途徑和葉綠素代謝途徑中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)

由于TMV的侵染對(duì)光合系統(tǒng)影響最大[9]，因此對(duì)TMV侵染煙株不同時(shí)間蛋白質(zhì)組中葉綠體相關(guān)的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1所示。隨著接種TMV時(shí)間延長(zhǎng)，光合途徑中上調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目逐漸增加，下調(diào)的蛋白質(zhì)數(shù)目逐漸減少；而卟啉代謝與葉綠素代謝途徑中上調(diào)蛋白質(zhì)數(shù)目減少，下調(diào)蛋白質(zhì)逐漸增多。說(shuō)明TMV在侵染煙株的過(guò)程中，卟啉代謝與葉綠素代謝途徑中的一些蛋白質(zhì)出現(xiàn)代償性的表達(dá)，減少了TMV對(duì)光合途徑的破壞，以最大限度維持煙株生存的需要。

從蛋白質(zhì)組中篩選出6個(gè)TMV侵染后差異顯著的蛋白質(zhì)，其在不同時(shí)間的表達(dá)水平變化如表2所示。光合途徑中的PSⅡ 32 ku protein、PSⅠ P700 apoprotein A1、 Cytochrome b/f complex subunit Ⅳ在12、24、36 h表達(dá)量均下調(diào)，而Oxygen-evolving enhancer protein 1在12、24、36 h表達(dá)量上調(diào)；卟啉代謝與葉綠素代謝途徑中的Geranylgeranyl diphosphate reductase在12、24、36 h表達(dá)量上調(diào)，Short-chain dehydrogenase TIC 32在12、24、36 h表達(dá)量也上調(diào)，但24 h上調(diào)的幅度降低。

圖1 TMV侵染后不同時(shí)間差異蛋白質(zhì)的富集分析

表2 接種TMV后不同時(shí)間差異蛋白質(zhì)的表達(dá)變化

為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)基因水平的變化，采用qRT-PCR檢測(cè)光合途徑中的PsbA(編碼PSⅡ 32 ku protein)、PetD(編碼Cytochrome b/f complex subunit Ⅳ)、PsaA(編碼PSⅠ P700 apoprotein A1)、Oxygen-evolvingenhancerprotein1以及卟啉代謝和葉綠素代謝途徑中的Geranylgeranyldiphosphatereductase、Short-chaindehydrogenaseTIC32這6個(gè)基因表達(dá)量的變化。從圖2可知，這些差異蛋白質(zhì)的mRNA表達(dá)水平與蛋白質(zhì)組中的數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)相同，如Geranylgeranyldiphosphatereductase基因表達(dá)水平在12 h上升3倍、24 h上升6.9倍、36 h 上升8.5倍，Short-chaindehydrogenaseTIC32基因表達(dá)水平在12 h上升3.5倍、24 h上升3.59倍、36 h 上升4.5倍，暗示這些蛋白質(zhì)的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上。

圖2 接種TMV后不同時(shí)間差異蛋白質(zhì)基因的表達(dá)變化

2.2 不同制劑對(duì)光合系統(tǒng)和葉綠素代謝的保護(hù)作用

為了檢測(cè)制劑A和制劑B對(duì)煙草光合系統(tǒng)的保護(hù)效果，以目前市售的防治TMV效果較好的寧南霉素制劑為陽(yáng)性對(duì)照，分別處理煙草葉片,采用qRT-PCR檢測(cè)差異蛋白質(zhì)基因的變化。結(jié)果顯示(圖3)，經(jīng)過(guò)制劑B處理的煙株光合途徑中的Oxygen-evolvingenhancerprotein1及卟啉代謝和葉綠素代謝途徑中的Short-chaindehydrogenaseTIC32基因表達(dá)水平明顯高于其他處理組，同時(shí)光合途徑中的PsbA、PetD、PsaA下調(diào)幅度明顯低于其他處理組。

圖3 不同處理接種TMV后差異蛋白質(zhì)基因的表達(dá)變化

2.3 不同制劑處理后N基因和病程相關(guān)蛋白基因的檢測(cè)

N基因是煙草中抗TMV的標(biāo)志基因[14]，而病程相關(guān)蛋白基因PR1-a可以反映植物抗病原物的能力[15]。為了進(jìn)一步確定所復(fù)配的制劑對(duì)TMV的防治效果，對(duì)N和PR1-a的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，接種TMV后，煙草體內(nèi)的N和PR1-a表達(dá)量均升高，制劑B處理的煙株體內(nèi)表達(dá)量較陰性對(duì)照高，同時(shí)也比陽(yáng)性對(duì)照高(圖4)，表明制劑B可以促進(jìn)煙株體內(nèi)抗性基因的表達(dá)。

2.4 不同制劑防治TMV的效果驗(yàn)證

珊西煙接種TMV后能產(chǎn)生枯斑，并且枯斑數(shù)量與TMV含量呈正相關(guān)[16]。為了進(jìn)一步證實(shí)制劑B防治TMV的效果，采用半葉法檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖5)：制劑A處理過(guò)的半葉總枯斑數(shù)為246個(gè)，對(duì)照半葉總枯斑數(shù)為294個(gè)，枯斑抑制率為35.03%；制劑B處理過(guò)的半葉總枯斑數(shù)為75個(gè)，對(duì)照半葉總枯斑數(shù)為296個(gè)，枯斑抑制率為74.67%;寧南霉素處理過(guò)的半葉總枯斑數(shù)為132個(gè)，對(duì)照半葉總枯斑數(shù)為279個(gè)，枯斑抑制率為52.69%。說(shuō)明制劑B 對(duì)TMV有良好的防治效果。

圖4 不同處理接種TMV后N和PR1-a的表達(dá)變化

左半片葉上噴施藥劑，右半片葉上不噴施圖5 不同制劑處理對(duì)TMV的防治效果

3 結(jié)論與討論

已知病毒侵染植物導(dǎo)致的以褪綠為特征的花葉病癥狀與葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的變化有關(guān)，病毒侵染的植株表現(xiàn)出光合速率下降、光合電子傳遞速率降低[17-18]，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)出現(xiàn)異常。為了更明晰地闡述病毒侵染對(duì)寄主光合系統(tǒng)中蛋白質(zhì)變化的動(dòng)態(tài)影響，本研究采用iTRAQ技術(shù)分析了TMV侵染不同時(shí)間段的蛋白質(zhì)組變化，從中篩選出TMV侵染后光合系統(tǒng)中表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)，包括PSⅡ 32 ku protein、PSⅠ P700 apoprotein A1、Cytochrome b/f complex subunit Ⅳ、Oxygen-evolving enhancer protein 1、Geranylgeranyl diphosphate reductase、Short-chain dehydrogenase TIC 32等。病毒能夠破壞植物葉綠體結(jié)構(gòu)，其外殼蛋白在葉綠體中積累并與類囊體相結(jié)合，導(dǎo)致PSⅡ中心復(fù)合體的缺損和產(chǎn)生活性氧[19]，這些與葉綠體D1蛋白(PSⅡ 32 ku protein)表達(dá)水平降低有關(guān)，D1蛋白作為光系統(tǒng)Ⅱ中的關(guān)鍵蛋白，它的快速周轉(zhuǎn)是PSⅡ發(fā)揮功能的必要條件[20]；Oxygen-evolving enhancer protein 1蛋白與電子傳遞鏈有關(guān)，同時(shí)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其參與了水稻白葉枯病的發(fā)生[10]；PSⅠ P700 apoprotein A1蛋白是PSⅠ反應(yīng)中心復(fù)合體的重要組成部分；細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體參與光合作用電子傳遞過(guò)程，而PetD編碼的Cytochrome b/f complex subunit Ⅳ是細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體發(fā)揮功能必不可少的；葉綠素和卟啉環(huán)代謝中的蛋白質(zhì)Geranylgeranyl diphosphate reductase能夠促進(jìn)葉綠素的合成，Short-chain dehydrogenase TIC 32蛋白具有NADPH依賴性脫氫酶活性，其表達(dá)變化對(duì)光合作用中能量捕獲有重要影響。由于這些蛋白質(zhì)對(duì)維護(hù)光合系統(tǒng)的功能具有重要作用，因此，以此作為分子靶標(biāo)檢測(cè)本研究復(fù)配的抗病毒制劑的作用效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其防治效果與這些蛋白質(zhì)的表達(dá)變化密切相關(guān)，加之半葉法檢測(cè)病斑的發(fā)生情況，證明了抗病毒制劑B對(duì)煙草花葉病有一定的防治效果，為下一步有針對(duì)性地干預(yù)這些蛋白質(zhì)篩選特定藥物奠定了基礎(chǔ)。

復(fù)配的抗TMV制劑B的主要成分3%鹽酸嗎啉胍并不是通過(guò)直接干預(yù)所篩選出的光合系統(tǒng)蛋白質(zhì)達(dá)到防治TMV的目的，其誘導(dǎo)的抗性基因的快速表達(dá)提高了煙株的抗性，同時(shí)該成分能夠抑制病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶活性[21]，減緩了病毒利用寄主資源復(fù)制的速度或抑制了病毒的繁殖速度，兩者從不同層面對(duì)病毒的進(jìn)一步侵染進(jìn)行了遏制，導(dǎo)致制劑B處理的煙株與對(duì)照相比枯斑數(shù)大大減少，因此制劑B對(duì)煙草花葉病具有一定的防治效果。