劉曉柱,李銀鳳,于志海,劉曉輝

(貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽 550003)

丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepathovartomato，Pst)DC3000是番茄、辣椒等茄科植物的一類病原菌，為丁香假單胞菌屬，革蘭氏陰性短桿狀菌，有鞭毛，無莢膜，無芽孢，最適pH值為7.0，最適生長溫度為24～30 ℃，在KBM培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃綠色熒光[1-3]。PstDC3000引起的番茄細菌性斑點病，危害番茄的葉片、葉柄、莖、花和果實，對番茄的質(zhì)量和產(chǎn)量影響嚴重[4-6]。

甘油是一種代謝中間產(chǎn)物，廣泛存在于微生物、動物和植物中，參與生物的多種脅迫反應(yīng)，包括非生物脅迫和生物脅迫[7-9]。在病原菌和植物的相互作用中，病原菌需要從植物中獲取營養(yǎng)物質(zhì)才能滿足自身生存的需要。在某些情況下，甘油甚至可以作為病原微生物的唯一碳源物質(zhì)，而且病原微生物中甘油代謝途徑的阻斷可以影響病原菌的形態(tài)和致病性[10]。

甘油在甘油激酶(Glycerol kinase，GK)的催化下，分解形成3-磷酸-甘油(G3P)。G3P在輔酶NAD+的參與下，被磷酸甘油脫氫酶催化形成磷酸二羥丙酮(DHAP)，其隨后參與三羧酸循環(huán)。因此，GK是甘油利用過程中的限速酶。目前已獲得了多種生物的GK基因序列，包括大腸桿菌、擬南芥、果蠅、斑馬魚、爪蟾、小鼠、人類等[11-15]，但尚未見對PstDC3000GK基因的研究報道。

鑒于GK是甘油代謝中的關(guān)鍵酶，結(jié)構(gòu)相對保守，本研究根據(jù)GenBank中PstDC3000 GK氨基酸序列(PSPTO_4168)設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)克隆了PstDC3000GK基因，并對其生物信息學(xué)特征進行了分析。然后，利用插入突變的方法，敲除PstDC3000GK基因，探討GK基因缺失對PstDC3000的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 野生型PstDC3000、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒(pK18mob、pLAFR、pRK2073)均由貴州理工學(xué)院微生物學(xué)實驗室保存。克隆載體pMD-18-T購自TAKARA公司。

1.1.2 試劑及試劑盒 蛋白胨、甘油、瓊脂、常用抗生素購自上海生工生物有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純，購于廣州化學(xué)試劑有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒購于上海生工生物有限公司；TaqDNA聚合酶、ExTaqⅡ master mix、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等均為TAKARA公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、TSA、KBM與M9培養(yǎng)基的配制參考《分子克隆實驗指南》[16]。

1.2 試驗方法

1.2.1PstDC3000GK基因的克隆 嚴格參考試劑盒說明書提取PstDC3000基因組DNA，通過核酸紫外分光法分析其質(zhì)量與濃度。以GenBank中所提交的PstDC3000 GK氨基酸序列為依據(jù)，利用Primer 5.0分析軟件，設(shè)計1對克隆引物(表1)。

表1 研究中所用引物

注：下劃線部分為酶切位點。

以PstDC3000 基因組DNA為模板，通過PCR的方法擴增GK基因，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；最后72 ℃終末延伸10 min。PCR結(jié)束后，凝膠電泳分析，通過DNA膠回收試劑盒進行純化，將產(chǎn)物連接至克隆載體(pMD-18-T)上，通過熱激法將重組DNA分子轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，Amp抗性和X-gal/IPTG藍白斑篩選陽性克隆。挑取白色菌落進行PCR檢測，將陽性克隆進行液體培養(yǎng)，采用試劑盒方法提取質(zhì)粒后，雙酶切法進行檢測，挑選PCR檢測與雙酶切檢測均為陽性的菌落，送上海生工生物公司進行測序。

1.2.2PstDC3000GK基因序列分析 利用生物軟件(DNAMAN和BioEdit)對PstDC3000GK基因序列進行ORF查找與翻譯。通過序列處理在線工具包(SMS)、瑞士生物信息學(xué)研究中心蛋白質(zhì)專業(yè)分析系統(tǒng)以及國際生物測量學(xué)與進化生物學(xué)實驗室在線系統(tǒng)等分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)。

1.2.3PstDC3000GK基因缺失突變體的構(gòu)建 利用整合突變的方式，借助輔助質(zhì)粒pRK2073，通過三親本結(jié)合實現(xiàn)對PstDC3000GK基因的敲除。方法如下：根據(jù)PstDC3000 GK氨基酸序列設(shè)計缺失突變引物(表1)，利用野生型PstDC3000菌體基因組DNA為模板，進行PCR擴增，方法參考1.2.1。分別將受體菌PstDC3000、供體菌(帶有重組質(zhì)粒的DH5α)、輔助菌DH5α/pRK2073接種在含適當抗生素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.6～1.0。以受體菌∶輔助菌∶供體菌=2∶1∶2的比例收集菌體，棄上清，生理鹽水洗2次。然后用KBM洗一次，去上清，用50 μL生理鹽水懸浮菌體，最后將菌體滴在KBM固體平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)過夜的三親結(jié)合菌體用0.2 mL KBM從平板上洗下，涂到含相應(yīng)抗生素的KBM平板上，培養(yǎng)2～3 d，長出的菌落進行PCR檢測。將構(gòu)建正確的GK基因缺失突變體命名為PstDC3000 △GK。

1.2.4PstDC3000GK基因回復(fù)突變體的構(gòu)建 根據(jù)PstDC3000 GK氨基酸序列設(shè)計1對GK基因全長回復(fù)突變引物(表1)。以PstDC3000菌體基因組DNA為模板，進行PCR擴增，方法參考1.2.1。將構(gòu)建正確的回復(fù)突變質(zhì)粒通過三親本結(jié)合方式轉(zhuǎn)化至GK基因突變體中，實現(xiàn)GK基因缺失的回復(fù)突變。將構(gòu)建正確的GK基因缺失回復(fù)突變體命名為PstDC3000 △GK/pLA。

1.2.5GK基因表達量的檢測 采用實時熒光定量PCR的方法(羅氏Lightcycler 480系統(tǒng))檢測PstDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA中GK的表達量。以16S RNA為內(nèi)參，擴增體系：10 μmol/L 引物 各0.8 μL，2×SYBR Green Mix 10 μL，基因組DNA 2 μL，補水至20 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；最后72 ℃終末延伸10 min。按照2-ΔΔCt方法分析GK的相對表達量。

1.2.6 菌體生長特性測定 將待測菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA過夜培養(yǎng)，調(diào)整至OD600=0.5，以5%的接種量轉(zhuǎn)接到200 mL含相應(yīng)抗生素的KBM、TSA及M9培養(yǎng)基中，設(shè)3個平行重復(fù)。28 ℃搖床振蕩培養(yǎng)78 h，每6 h或12 h取樣測定OD600值。以生長時間為橫坐標、各時間點OD600值為縱坐標繪制菌體生長曲線。

1.2.7 甘油含量測定 將待測菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA過夜培養(yǎng)，4 000 r/min離心2 min收集菌體，加入Tris-HCl重懸，超聲破碎儀破碎菌體細胞，4 000 r/min離心2 min收集上清液，用于HPLC測定。進樣體積為10 μL；色譜柱為氨基柱；流動相為乙腈∶水(75∶25)；流速1.0 mL/min；檢測器為RID。按照甘油標準品的峰面積值大小分析樣品中甘油的含量。

1.2.8 菌體侵染性測定 將菌株P(guān)stDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA過夜培養(yǎng)至OD600=1.0，收集菌體，用MgCl2溶液(10 mmol/L)稀釋菌體至OD600=0.000 2(105cfu/mL)，加入終體積分數(shù)為0.2%的Silwet L-77。

選取生長健壯、3周左右的野生型擬南芥(Col-0)葉片，進行接種試驗。通過注射器將菌體注入葉片內(nèi)，擦拭多余菌液，保濕。接種1 h(0 d)、4 d后，打孔器取樣，放進已稱質(zhì)量的EP管中。然后再次稱質(zhì)量，計算出葉片的質(zhì)量。充分磨碎葉片，用MgCl2溶液(10 mmol/L)將菌體稀釋成適當?shù)臐舛龋坎荚诤m當抗生素的KBM平板上，28 ℃培養(yǎng)36 h，計數(shù)菌落，計算lg值。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，用Excel中t測試分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pst DC3000 GK基因的克隆

采用試劑盒法提取的PstDC3000基因組DNA，經(jīng)紫外核酸蛋白儀檢測顯示，OD260/OD280=1.97，質(zhì)量濃度為735.3 μg/mL。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，DNA為整齊單一條帶，無彌散(圖 1)，其質(zhì)量與濃度完全達到作為PCR模板的要求。

M：1 kb DNA Ladder；1，2：基因組DNA圖1 Pst DC3000基因組DNA凝膠電泳分析

以PstDC3000基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，擴增得到1條約1 500 bp大小的特異性條帶(圖2)。

測序結(jié)果表明，PstDC3000GK基因全長1 506 bp，可編碼一條501個氨基酸組成的多肽(圖3)。BLAST顯示，克隆的PstDC3000 GK氨基酸序列與GenBank中登錄的序列相似性為100%，說明已成功克隆了PstDC3000GK基因。

2.2 Pst DC3000 GK序列分析

2.2.1 GK蛋白等電點及大小分析 瑞士生物信息學(xué)研究中心蛋白質(zhì)專業(yè)分析系統(tǒng)在線結(jié)果顯示，PstDC3000 GK蛋白分子質(zhì)量為55.8 ku，等電點為5.54。

M: DL10000 DNA Marker；1,2：目的片段擴增結(jié)果圖2 Pst DC3000 GK基因PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析

2.2.2 GK蛋白氨基酸組成分析 序列處理在線工具包(SMS)分析結(jié)果表明，PstDC3000 GK堿性氨基酸(K、R)個數(shù)為49；酸性氨基酸(D、E)個數(shù)為42；疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)個數(shù)為241；極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)個數(shù)為157；脂肪族氨基酸(I、L、V)有101個；芳香族氨基酸(F、W、Y)有45個。

圖3 Pst DC3000 GK基因及其編碼的氨基酸序列

2.2.3 GK蛋白信號肽切割位點預(yù)測分析 SignalP V3.0 WorldWide Web Server分析顯示，PstDC3000 GK蛋白信號肽位于 N-端第1位與32位氨基酸殘基之間，成熟蛋白質(zhì)為 469個氨基酸。

2.2.4 GK蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析 國際生物測量學(xué)與進化生物學(xué)實驗室及蛋白質(zhì)生物學(xué)和化學(xué)研究所的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)在線預(yù)測結(jié)果表明：PstDC3000 GK無規(guī)卷曲為53.29%，α-螺旋為25.95%，β-折疊為20.76%。

2.3 GK缺失對Pst DC3000的影響

2.3.1GK缺失及回復(fù)突變體的構(gòu)建 熒光定量PCR結(jié)果顯示，通過整合突變后，PstDC3000 △GK中GK基因已被敲除，沒有表達。回復(fù)突變體PstDC3000 △GK/pLA中，GK基因已被恢復(fù)，表達量接近野生型水平(圖4)。

2.3.2GK基因缺失對菌體生長的影響 在M9基本培養(yǎng)基中，PstDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA均生長良好，說明PstDC3000 △GK不是營養(yǎng)缺陷型。但突變體PstDC3000 △GK生長速率與PstDC3000相比，明顯變慢，回復(fù)菌PstDC3000 △GK/pLA的生長基本得到恢復(fù)，與PstDC3000相比沒有差異(圖5A)。

圖4 GK基因表達量分析

在TSA(不含甘油)培養(yǎng)基中，PstDC3000、PstDC3000 △GK及PstDC3000 △GK/pLA的生長速率明顯高于M9培養(yǎng)基中的生長速率。同樣，GK突變體的生長速率明顯降低，而回復(fù)突變體的生長速率基本恢復(fù)正常(圖5B)。

在KBM培養(yǎng)基(含甘油)中，PstDC3000 △GK的生長速率同樣低于PstDC3000和PstDC3000 △GK/pLA，且差異明顯大于TSA培養(yǎng)基(5C)。

A：M9培養(yǎng)基；B：TSA培養(yǎng)基；C：KBM培養(yǎng)基圖5 菌體在液體培養(yǎng)基中的生長速率

2.3.3GK基因缺失對菌體甘油含量的影響 測定結(jié)果表明，GK基因缺少導(dǎo)致PstDC3000△GK細胞內(nèi)積累高濃度的甘油，PstDC3000△GK/pLA細胞內(nèi)甘油含量基本恢復(fù)至野生型水平(圖6)。

**表示與Pst DC3000組相比，差異極顯著(P<0.01)圖6 GK基因缺失對菌體甘油含量的影響

2.3.4GK基因缺失對菌體侵染性的影響 試驗結(jié)果表明，接種野生型Col-0擬南芥4 d后，PstDC3000△GK菌體克隆數(shù)顯著低于PstDC3000，而PstDC3000△GK/ pLA菌體數(shù)量接近PstDC3000的水平(圖7)。

*表示與Pst DC3000組相比，差異顯著(P<0.05)圖7 菌體在擬南芥葉片上的克隆數(shù)

3 結(jié)論與討論

GK催化甘油生成3-磷酸-甘油，是甘油代謝中的關(guān)鍵酶。GK基因先后從大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)以及腦膜炎膿毒性黃桿菌(Flavobacteriummeningosepticum)等多種微生物細胞中被克隆出來，在大腸桿菌中進行了原核表達，同時酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)也得到了分析[17-19]。2003年Buell等[20]報道了PstDC3000的全基因組序列，并且確定了298個致病毒性基因，這是丁香假單胞菌屬中第1個被完全測序的菌株，該工作的完成為研究PstDC3000的致病機制奠定了基礎(chǔ)。然而PstDC3000作為研究植物與微生物互作的模式菌株，目前還未見有關(guān)其GK的報道，其功能還未知，因此，本研究根據(jù)GenBank中PstDC3000 GK氨基酸序列設(shè)計引物，通過PCR技術(shù)擴增到了PstDC3000GK基因，且對其生物信息學(xué)特征進行了分析。然后，利用插入突變的方法敲除PstDC3000GK基因，探討GK基因缺失對PstDC3000的影響。

在本研究中，克隆的PstDC3000GK基因大小1 506 bp，具有編碼501個氨基酸的開放閱讀框。PstDC3000 GK的分子質(zhì)量為55.8 ku，成熟蛋白由469個氨基酸組成，二級結(jié)構(gòu)中富含無規(guī)卷曲，含量高達53.29%。通過敲除PstDC3000GK基因后，菌株在基本培養(yǎng)基和豐富培養(yǎng)基中的生長速率均明顯低于野生型，而回復(fù)突變體的生長速率基本恢復(fù)正常。GK基因缺失后，突變體內(nèi)積累高濃度的甘油，而高濃度的甘油對細胞有一定的毒害作用，這可能是導(dǎo)致菌體生長緩慢的原因。另外，接種野生型Col-0擬南芥4 d后，GK基因缺失突變菌數(shù)量顯著低于野生型，說明GK基因影響PstDC3000菌體在植物上的增殖。

GK作為甘油代謝中的關(guān)鍵酶，廣泛參與調(diào)控植物的抗病、抗逆等多種生物脅迫與非生物脅迫，在農(nóng)業(yè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。在植物中，NHO1基因編碼一個GK，被認為是抵御多重復(fù)合非宿主病原菌P.syringase的關(guān)鍵基因，具有對非寄主病原菌的非特異抗性。在擬南芥對非寄主病原菌產(chǎn)生的“基因?qū)颉笨剐灾校琋HO1亦不可缺少，參與調(diào)控擬南芥對病原菌的抗性過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，GK基因參與調(diào)控PstDC3000的甘油代謝過程，影響其生長速率與侵染性，為相關(guān)病害的控制提供了一定的理論參考。