夏 晴，麥艷娜，董振杰，劉文軒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界三大谷類作物之一，也是我國重要的糧食作物。河南省是我國小麥的最適生態(tài)區(qū)，小麥播種面積和總產(chǎn)量均居全國之首，河南省小麥生產(chǎn)對我國糧食安全和社會穩(wěn)定起著重要作用[1]。由布氏白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的小麥白粉病是一種世界性小麥真菌病害，也是影響小麥生產(chǎn)的三大主要病害之一[1]。小麥白粉病主要發(fā)生在葉片上，也可發(fā)生于植株葉鞘、莖稈和穗部。小麥感染白粉病后，攝入養(yǎng)分減少，葉片早枯，從而影響葉片光合作用，致使成穗率減少、千粒質(zhì)量下降，品質(zhì)與產(chǎn)量都受到嚴(yán)重影響[2]。20世紀(jì)70年代以后，由于種植密度的提高和水肥使用量的增加，致使小麥白粉病不斷擴展蔓延，發(fā)病程度逐漸加重。河南省是小麥白粉病的重發(fā)區(qū)，白粉病多次大面積流行成災(zāi)，成為小麥生產(chǎn)亟待解決的重大災(zāi)害性問題之一。目前，防治小麥白粉病的主要措施有藥物防治和選育抗病小麥品種兩大類。噴施農(nóng)藥雖然可以起到一定的防治效果，但會給農(nóng)民和政府帶來較大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，而且污染生態(tài)環(huán)境。因此，培育和利用高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病小麥新品種是公認(rèn)的防治小麥白粉病危害最為經(jīng)濟有效的途徑[3]。

培育抗白粉病小麥品種的方法有很多，但目前還是以傳統(tǒng)雜交育種為主，而抗病基因是利用雜交育種培育抗病新品種的關(guān)鍵。迄今正式命名的白粉病抗性基因有83個(Pm1—Pm60)[4-6]，但目前真正能被育種家利用的抗病基因非常有限。由于白粉病抗源單一品種的大面積推廣種植，部分原有的抗病基因隨著流行菌株的變化和白粉菌新菌株的出現(xiàn)而成為低效或無效抗病基因[7]。此外，部分抗病基因的載體品種農(nóng)藝性狀差，或伴隨有不良性狀，真正能用于我國小麥抗白粉病育種的基因資源十分有限。因此，不斷發(fā)掘與利用抗白粉病基因新資源，創(chuàng)造優(yōu)異抗病新種質(zhì)，是我國培育抗白粉病小麥新品種的迫切需求。

小麥抗白粉病基因的來源目前有普通小麥、小麥近緣種屬和野生親緣種屬等。其中，小麥野生親緣種屬類型繁多，蘊藏著極其豐富的抗病基因，是小麥白粉病抗病基因的最重要來源。目前有效命名的79個抗白粉病基因中，20個(25.32%)來自10類小麥野生親緣種屬，為小麥抗病育種做出了巨大貢獻。但與普通小麥基因相比，來自小麥野生種屬的外源基因只有通過誘導(dǎo)外源染色體與小麥重組形成小麥-野生親緣種屬易位系后才能被小麥抗病育種所利用。目前，最常用于鑒定小麥-野生親緣種屬易位系的方法為基因組原位雜交(Genomicinsituhybridization,GISH)和外源染色體特異分子標(biāo)記。其中，GISH可以直觀鑒定小麥與外源染色體的易位，但其有效性依賴于外源染色體與小麥染色體的部分同源性程度和研究者的技術(shù)水平，且耗時費力。而分子標(biāo)記不受環(huán)境、基因表達與否等因素的限制，同時具有數(shù)量豐富、多態(tài)性強以及操作簡便的特點[8]，為外源染色體易位系的大規(guī)模篩選提供了極大便利。外源染色體特異分子標(biāo)記篩選與GISH鑒定相結(jié)合可以極大提高向小麥轉(zhuǎn)移外源抗病基因的效率[9]。

本研究利用河南省流行的白粉病混合菌株對收集的100份小麥-野生親緣種屬添加系苗期接種，進行抗性鑒定和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定[10]，評價其抗性表現(xiàn)，發(fā)掘白粉病新抗源；并利用小麥表達序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags，EST)開發(fā)STS(Sequence tagged site)分子標(biāo)記，根據(jù)小麥全長cDNA序列比對小麥親緣物種基因組序列開發(fā)FlcDNA(Full-length cDNA)分子標(biāo)記[11]，篩選攜帶抗病基因的外源染色體特異分子標(biāo)記，為創(chuàng)造抗病新種質(zhì)、培育抗白粉病小麥新品種提供抗病新基因分子標(biāo)記選擇技術(shù)[12]。

1 材料和方法

1.1 供試品種和菌株

供試材料為100份小麥-野生親緣種屬添加系，添加系的親緣種屬來源見表1。以攜帶免疫白粉病基因Pm21的抗病小麥品種國麥301和高感白粉病的中國春(Chinese spring，CS)作對照。小麥白粉病混合菌株由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，以高感白粉病小麥品種中國春進行活體繁菌保存。

表1 小麥-野生親緣種屬添加系列表

續(xù)表1 小麥-野生親緣種屬添加系列表

注：ALCD1遺傳背景材料是英國小麥品種ALCD，其他材料的遺傳背景是中國春小麥；#后標(biāo)注數(shù)字用于區(qū)分不同登記編號的同一親緣種屬染色體添加系；DA 表示外源染色體二體添加系，DtA表示外源端著絲粒染色體二體添加系；? 表示添加系中的外源染色體同源群目前暫未確定。

1.2 接種及鑒定方法

1.2.1 白粉病苗期抗性鑒定 白粉病抗性鑒定采用人工接菌鑒定法，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)恒溫培養(yǎng)室內(nèi)進行，接種小麥白粉病混合菌株。

將100份試驗材料與對照品種播種于32孔(6 cm×6 cm)育苗盤內(nèi)，每份材料播種1穴，每穴5粒，每盤種植1穴中國春作為感病對照。播種后的小麥材料置于18～20 ℃、濕度70%、光照時間16 h/d的環(huán)境下培養(yǎng)。至一葉一心且第一片葉完全展開時，將已充分發(fā)病的中國春置于待鑒定幼苗培養(yǎng)盤的四周，定期抖落孢子接種白粉菌。待接種7～15 d，感病對照中國春充分發(fā)病時，調(diào)查記載各材料的白粉病抗性。將初步鑒定對白粉病具有抗性的品種二次播種，接種白粉菌，重復(fù)鑒定其抗性。

抗病性鑒定采用盛寶欽[13]提出的0～4級調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)記載每個植株的反應(yīng)型。根據(jù)葉片受侵染嚴(yán)重程度分為6種反應(yīng)型，分別為免疫(IT = 0)、近免疫(IT = 0;)、高抗(IT = 1)、中抗(IT = 2)、中感(IT = 3)和高感(IT = 4)。其中，0～2級屬于抗病類型，3～4級屬于感病類型，劃分標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 小麥白粉病苗期反應(yīng)型分級標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)染色觀察 幼苗接種白粉菌7 d后剪取1～2 cm葉段，在乙醇∶冰醋酸(3∶1，V/V)混合液中過夜脫色，使葉段透明，隨后用去離子水漂洗葉段2次。沖洗后用考馬斯亮藍(lán)R250∶甲醇∶水∶乙酸(0.05∶50∶40∶10，m/V/V/V)混合液染色10～15 min，染色后的葉段用去離子水漂洗后儲存于冰乙酸∶甘油∶水(5∶20∶75，V/V/V)混合液中，在OLYMPUS CX41型光學(xué)顯微鏡下觀察葉段上白粉菌的生長和分布情況[14]。

1.3 白粉病新抗源分子標(biāo)記篩選

對鑒定為抗白粉病的小麥-野生種屬添加系試驗材料采用SDS法提取基因組DNA。根據(jù)小麥EST設(shè)計了29個STS分子標(biāo)記；根據(jù)從小麥FLcDNA數(shù)據(jù)庫[15]獲取的小麥全長cDNA序列，比對山羊草、黑麥、大麥、水稻、短柄草等物種的基因組序列[16]，以比對出的內(nèi)含子序列為模板設(shè)計引物，開發(fā)了77個FlcDNA分子標(biāo)記。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

PCR擴增在TC-XP型基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)上進行。PCR反應(yīng)體系(15 μL)組分為：7.5 μL 2×TaqMasterMix，0.5 μL引物(10 μmol/L)，2 μL基因組DNA(100～200 ng/μL)，5 μL去離子水。PCR擴增程序為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 20 s，退火 20 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物分別用6種限制性內(nèi)切酶(AluⅠ、HaeⅢ、MseⅠ、MspⅠ、RsaⅠ、MboⅠ)在37 ℃酶切2 h。酶切產(chǎn)物用含有溴化乙錠的3%瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測，最后在凝膠成像系統(tǒng)中掃描觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病苗期抗性鑒定結(jié)果

利用河南省白粉病混合菌株對100份小麥-野生親緣種屬添加系進行苗期抗性鑒定。結(jié)果表明，6份材料表現(xiàn)為抗病，占全部材料的6.00%。其中，免疫和近免疫材料有3份，親緣種屬來源分別為沙融山羊草、高大山羊草、尾狀山羊草；高抗有2份，親緣種屬來源分別為兩芒山羊草、高大山羊草；中抗材料有1份，親緣種屬來源為高大山羊草(表3)。

表3 小麥-野生種屬添加系苗期白粉病抗性鑒定結(jié)果

2.2 考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果能夠進一步驗證苗期表型鑒定的準(zhǔn)確性。在麥苗接種白粉菌7 d后取樣，考馬斯亮藍(lán)染色使小麥葉片組織呈現(xiàn)透明，白粉菌孢子、芽孢及后續(xù)發(fā)育形成的分生孢子等結(jié)構(gòu)被染成結(jié)構(gòu)清晰、反差明顯的深色。以小麥-高大山羊草3Sl#3添加系(CS-AELON DA 3Sl#3)為例，該添加系是在中國春小麥的遺傳背景中添加了1對高大山羊草3Sl#3染色體。根據(jù)苗期接種表型，中國春為高感，而CS-AELON DA 3Sl#3為高抗；觀察考馬斯亮藍(lán)染色的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中國春葉段染色后在顯微鏡下可以觀察到大片菌落和分生孢子，而CS-AELON DA 3Sl#3在顯微鏡下只可以觀察到少量附著胞芽管(圖1A)，說明表型鑒定與考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果一致，抗性鑒定可靠。

2.3 抗白粉病小麥-野生親緣種屬添加系外源染色體特異分子標(biāo)記篩選

根據(jù)小麥EST和全長cDNA共設(shè)計了106個分子標(biāo)記，利用PCR方法對抗病添加系基因組DNA進行擴增，從中篩選出了12個外源染色體特異分子標(biāo)記(表4)。其中，XBE404125/RsaⅠ和XBG313367/RsaⅠ 2個標(biāo)記為STS分子標(biāo)記，其余10個為FlcDNA 分子標(biāo)記。本研究開發(fā)的29個STS標(biāo)記中有2個為外源染色體特異分子標(biāo)記，占STS標(biāo)記總數(shù)的6.90%，而77個FlcDNA標(biāo)記中有10個為特異分子標(biāo)記，占12.99%，說明FlcDNA標(biāo)記在外源染色體中的多態(tài)性較STS標(biāo)記高得多。因此，根據(jù)小麥全長cDNA開發(fā)FlcDNA標(biāo)記在外源染色體特異分子標(biāo)記創(chuàng)制方面有更大的應(yīng)用潛力。

本研究篩選出的12個特異分子標(biāo)記在小麥-野生種屬添加系材料中有明顯區(qū)別于感病對照的特異擴增條帶。以篩選出的1個STS分子標(biāo)記(XBE404125/RsaⅠ)和3個FLcDNA分子標(biāo)記(X3S11/MspⅠ、X3S22/MseⅠ和X3S42/AluⅠ)為例，PCR模板分別為中國春小麥和CS-AELON DA 3Sl#3的基因組DNA，CS-AELON DA 3Sl#3相對中國春均有3Sl#3染色體特異擴增條帶(圖1B)。

A：小麥-野生親緣種屬添加系白粉病抗性鑒定。左：CS、CS-AELON DA 3Sl#3白粉病抗性的葉片表型鑒定；右：接種7 d后葉段的考馬斯亮藍(lán)染色。右上：CS；右下：CS-AELON DA 3Sl#3。B：外源染色體特異分子標(biāo)記篩選。Marker: 100 bp DNA Ladder; CS、DA 3Sl#3泳道下方為分子標(biāo)記名稱；白色箭頭指示外源染色體特異擴增條帶圖1 小麥-野生親緣種屬添加系白粉病抗性鑒定和外源染色體特異分子標(biāo)記篩選

表4 外源染色體特異分子標(biāo)記列表

3 結(jié)論與討論

本研究利用白粉病混合菌株對100份小麥-野生種屬添加系進行苗期接種抗性鑒定，初步篩選出6個小麥-野生種屬添加系對小麥白粉病混合菌株具有抗性。這6份添加系除ALCD-AECAU DA E#1外，其他5份小麥-野生種屬添加系都是在中國春小麥的遺傳背景中添加了1對外源染色體。中國春高感白粉病，因此，可以確定這5份抗病添加系的抗病基因都位于相應(yīng)的外源染色體上。添加系A(chǔ)LCD-AECAU DA E#1的遺傳背景材料是英國小麥品種ALCD，但該品種高感河南省小麥白粉菌，因此該添加系的抗病基因定位在外源染色體E上。目前，已經(jīng)命名的83個抗白粉病基因中，并沒有來源于高大山羊草4Sl#3和6Sl#3，沙融山羊草4Ssh#8，兩芒山羊草2Mbi#1和尾狀山羊草E#1染色體的抗病基因。所以，這5個染色體上的抗病基因應(yīng)該都是新的抗白粉病基因。在已正式定名的抗白粉病基因中，Pm13基因定位于高大山羊草3Sl染色體短臂[17],但本研究中小麥-高大山羊草抗白粉病添加系CS-AELON DA 3Sl#3的外源染色體與Pm13基因所在的3Sl染色體來源地不同，本研究中3Sl#3上的抗白粉病基因是Pm13的等位基因還是新基因尚需進一步研究確定。本研究鑒定的抗白粉病材料對拓展小麥白粉病抗性基因來源，培養(yǎng)優(yōu)良抗病小麥新品種具有重要意義。

小麥野生種屬來源的外源抗病基因?qū)π←溈共∮N和白粉病防治起到了關(guān)鍵作用。本研究篩選的抗白粉病添加系都是在小麥遺傳背景基礎(chǔ)上添加了1對外源染色體。由于添加的是整條外源染色體，不可避免會伴隨較多的不良性狀。此外，外源染色體在小麥背景中也常常會發(fā)生丟失，導(dǎo)致抗病性喪失。所以，外源抗白粉病基因只有通過誘導(dǎo)外源染色體片段與小麥染色體片段重組，創(chuàng)制小麥-野生親緣種屬易位系后，才能作為新抗源用于培育抗病小麥新品種。目前，外源染色體片段鑒定方法有基因組原位雜交[18]和分子標(biāo)記2種。其中，分子標(biāo)記數(shù)量多、多態(tài)性強以及快速簡便可靠，是鑒定外源基因的首選方法[19]。本研究篩選到了12個攜帶抗白粉病新基因外源染色體的特異分子標(biāo)記，其中10個為基于小麥全長cDNA開發(fā)的FlcDNA分子標(biāo)記，占FlcDNA標(biāo)記總數(shù)的12.99%。由此可見，F(xiàn)lcDNA分子標(biāo)記相對于目前常用的STS分子標(biāo)記具有數(shù)量多、擴增產(chǎn)物穩(wěn)定和易于檢測等優(yōu)點，更適用于開發(fā)小麥野生親緣種屬外源染色體的特異分子標(biāo)記。本研究篩選出的分子標(biāo)記為外源染色體的鑒別和進一步利用小麥-外源染色體易位系把抗白粉病新基因?qū)肫胀ㄐ←湹於嘶A(chǔ)。