吳建新，徐克東，王 偉，李成偉,4*，吳建宇

(1.河南農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002； 2.周口師范學院 植物遺傳與分子育種重點實驗室，河南 周口 466001； 3.河南省作物分子育種與生物反應器重點實驗室，河南 周口 466001；4.河南科技學院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

植物體細胞胚發(fā)生(Somatic embryogenesis, SE)是植物體細胞經(jīng)誘導或自發(fā)，重新編程其發(fā)生發(fā)育，轉(zhuǎn)化為胚性細胞，并進一步分化為體細胞胚的無性繁殖過程。植物體細胞胚屬于非合子胚，多起源于單細胞，異于無融合生殖胚，并區(qū)別于植物組培器官發(fā)生過程中芽與根的分化[1]。體細胞胚結(jié)構(gòu)具有發(fā)育兩極性[2]、高度敏感性、生理隔離性(可自然脫毒)、相對穩(wěn)定的遺傳性(再生植株變異率低)、高效再生性、發(fā)育重演性、適于懸浮培養(yǎng)，以及轉(zhuǎn)化無嵌合等優(yōu)點[3-6]。在基礎研究方面，體細胞胚是研究合子胚發(fā)育的理想試驗模型，具有合子胚無法比擬的可排除非胚性母體組織影響的優(yōu)勢[7-8]。在植物體細胞胚的應用研究方面，體細胞胚是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系、無性變異株系獲得[7]、體細胞雜交種資源創(chuàng)制、人工種子制備、種質(zhì)資源保存等研究的關鍵。植物高頻再生體系是高效遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建的重要前提，高效率的體細胞胚發(fā)生體系作為植物高頻再生體系的重要途徑之一，對于高效植物轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建也至關重要。同時，高效率的體細胞胚發(fā)生體系也是植物干細胞生物反應器構(gòu)建的重要研究基礎[3,5]。

自Steward等[9]、Reinert等[10]建立胡蘿卜體細胞胚發(fā)生體系以來，研究者已在多種被子植物、裸子植物和蕨類植物的組織、懸浮細胞系和原生質(zhì)體培養(yǎng)過程中成功誘導出了大量體細胞胚結(jié)構(gòu)。植物體細胞胚發(fā)生的常規(guī)結(jié)構(gòu)主要包括以下3種。(1)典型SE結(jié)構(gòu)。如雙子葉：原胚-球形胚-心形胚-魚雷胚-子葉胚；單子葉：原胚-球形胚-梨形或盾形胚；裸子植物：早期胚-晚期胚-子葉胚[2]；蕨類植物：線性原胚-早期胚葉-晚期胚葉[11]，或直接與間接綠球體(Green globular body,GGB)[12]；(2)蘭科類原球莖(Protocorm-like body,PLB)結(jié)構(gòu)；(3)薔薇屬PLB結(jié)構(gòu)[13-14]。為了更好地開展植物體細胞胚發(fā)生方面的研究，尤其是為了組建高效的植物干細胞生物反應器，筆者在國際上首次命名、報道了3種新型的植物體細胞胚結(jié)構(gòu)，分別為類蛙卵體(Frog egg-like body,FELB)[3,5]、類塊根體(Rhizoid tubers,RTB)[4]、類珠芽體(Bulbil-like body,BLB)[6]等。煙草是茄科的代表植物，也是植物學等相關研究的經(jīng)典模式材料。在基因工程研究方面，研究者利用轉(zhuǎn)基因的方法，將外源基因?qū)霟煵葜?，通過種植大面積的轉(zhuǎn)基因煙草，生產(chǎn)所需的疫苗或蛋白質(zhì)類藥物，如Ebola Zaire疫苗[15-16]的開發(fā)。然而，轉(zhuǎn)基因煙草干細胞系的發(fā)酵培養(yǎng)與大面積種植轉(zhuǎn)基因煙草相比，更利于疫苗、抗菌肽、植物源功能蛋白質(zhì)等基因工程產(chǎn)品的規(guī)?；a(chǎn)、富集、純化與開發(fā)。因此，在煙草中，成功構(gòu)建一種利于其干細胞挖掘與分離的體細胞胚發(fā)生結(jié)構(gòu)顯得尤為重要，該技術體系也將為其他植物尤其是我國傳統(tǒng)名貴中草藥的植物源活性物質(zhì)干細胞生物反應器[17-18]的構(gòu)建提供研究策略與思路。

1 材料和方法

1.1 植物材料的培養(yǎng)

選取種皮完整、顆粒飽滿的煙草(Nicotianatabacumvar W38)種子，于超凈工作臺中經(jīng)75%乙醇表面消毒30 s至1 min，無菌水沖洗3次，2.5%次氯酸鈉溶液消毒8～10 min，無菌水沖洗3～5次。將煙草種子播于1/2MS+10 g/L蔗糖(pH值5.8～6.06)的培養(yǎng)基上，16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃，培養(yǎng)20 d后可得到長勢良好的煙草無菌苗。

1.2 FELB誘導發(fā)生

在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的生長素類物質(zhì)NAA與2,4-D(0、5、10、15 mg/L)，其中含50 g/L蔗糖、7.8 g/L瓊脂粉，pH值5.80～6.06。培養(yǎng)基在0.15 kPa，121 ℃條件下濕熱滅菌20 min。取煙草無菌苗的根、莖和葉于無菌水中，將根、莖切成1 cm左右的莖段，葉片切至1 cm×1 cm左右的葉盤，置于無菌的濾紙上吸干多余水分。將葉片(近軸面向上)，莖段與根段(不考慮極性方向)平鋪于培養(yǎng)皿中誘導培養(yǎng)基上，再將培養(yǎng)皿分別于光照[150 μmol/(m2·s)]、黑暗條件下，(25±1)℃進行FELB誘導培養(yǎng)。

1.3 FELB胚體萌發(fā)再生誘導

在MS培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的BAP(0、0.5、1.0、1.5 mg/L)，其中含30 g/L蔗糖、7.8 g/L瓊脂粉，pH值5.80～6.06。培養(yǎng)基在0.15 kPa、121 ℃條件下濕熱滅菌18～20 min。將與母體分離的FELB個體(離體處理)或未與母體分離的FELB(原位處理)分別進行胚體萌發(fā)再生誘導。并于16 h光照[120 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(23±1)℃條件下進行胚體萌發(fā)培養(yǎng)。

1.4 叢生芽生根誘導

以1/2MS為基本培養(yǎng)基，加入10 g/L蔗糖、0.5 mg/L NAA、1 mg/L GA3，調(diào)節(jié)pH值5.80～6.06，并添加7.8 g/L瓊脂粉。培養(yǎng)基在0.15 kPa、121 ℃條件下濕熱滅菌18～20 min。待叢生芽生長至1～2 cm后，將其分株切下，置于生根培養(yǎng)基中，于16 h光照[150 μmol/(m2·s)]/8 h黑暗，(25±1)℃條件下進行生根培養(yǎng)。

1.5 FELB起源的組織學分析

將愈傷組織與不同發(fā)育時期的FELB結(jié)構(gòu)于4%的多聚甲醛固定液[溶解于100 mmol/L的PBS(Phosphate buffer solution)，pH值7.2]中固定48～72 h。然后，分別采用50、100 g/L的蔗糖溶液脫水24～36 h。采用OCT(Optimum cutting temperature compound)包埋劑包埋。最后，采用冷凍切片機(CM1850，徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，德國)將材料切成8～10 μm的切片，置于載玻片上，采用光學顯微鏡(Olympus BX 41)進行閱片鏡檢。

1.6 FELB結(jié)構(gòu)的胚性組化分析

通過雙染色法(伊文斯藍和醋酸洋紅)[3-5,19]，對所誘導的外植體(含有母體組織、特殊愈傷組織與FELB)進行雙染色胚性鑒定。利用單反相機(Canon 600 D)進行拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

煙草的特殊愈傷組織、FELB結(jié)構(gòu)的誘導發(fā)生概率與FELB胚體萌發(fā)發(fā)生概率數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析與差異顯著性檢測(ANOVA分析；99%和95%置信區(qū)間)[3-4,20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 FELB結(jié)構(gòu)的誘導

黑暗條件下，煙草的不同外植體(根、莖、葉)在含有10 mg/L 2,4-D的誘導培養(yǎng)基中誘導7 d后，外植體邊緣均出現(xiàn)了少量黏稠、透明的特殊愈傷組織(圖1B、C)，其中，葉片外植體的特殊愈傷誘導率可達100.00%，明顯高于根與莖段外植體的誘導效果(表1)。這與龍葵[3]、蔊菜[5]的FELB誘導過程中出現(xiàn)的特殊愈傷組織相同。14 d后在特殊愈傷組織中形成了淺色的類蛙卵狀體細胞胚結(jié)構(gòu)[3](圖1G)。在3種外植體中，葉片的誘導效果最佳，F(xiàn)ELB誘導率可至97.77%，莖段次之(75.90%)，根的誘導效果較差(71.40%)(表2)。而3種外植體在添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基中均未能成功誘導出FELB結(jié)構(gòu)。并且，在光照條件下，不同濃度的2,4-D與NAA的所有處理亦未能誘導出FELB結(jié)構(gòu)。當生長素類似物2,4-D的質(zhì)量濃度高于或小于10 mg/L時也可以誘導出特殊愈傷組織和FELB，但是數(shù)量明顯減少(表2)。經(jīng)過胚性鑒定的雙染色(伊文斯藍和醋酸洋紅)處理可以發(fā)現(xiàn)，胚性細胞被染成淺色，而非胚性組織被染成了深色(圖1H與I)。

A．葉片外植體，bar=1 cm； B．7 d后形成少量愈傷，bar=1 cm； C．B圖局部放大，bar=0.5 cm； D．10 d形成少量FELB，bar=1 cm；E．D圖局部放大，并具有透明的粘性愈傷組織，bar=0.25 cm； F．誘導15 d后的FELB，bar=1 cm；G．F圖局部放大，示發(fā)育中的FELB，bar=0.25 cm； H．25 d后形成大量FELB，經(jīng)伊文斯蘭與醋酸洋紅雙染色，淺色為FELB胚體，深色為非胚性組織，bar=1 cm； I．H圖局部放大，bar=0.25 cm圖1 煙草W38葉片外植體FELB結(jié)構(gòu)的誘導發(fā)生

表1 2,4-D對煙草根、莖、葉外植體特殊愈傷組織誘導率的影響%

注：愈傷組織誘導率是指產(chǎn)生愈傷組織的外植體總數(shù)與所有接種的煙草外植體總數(shù)之比。每個外植體單個處理組的平均值和標準差均由30個培養(yǎng)皿中的300個外植體(即30個重復)統(tǒng)計獲得；大、小寫字母分別表示在1%、5%的置信區(qū)間具有顯著差異，下同。

2.2 再生與生根誘導

將FELB外植體(離體與原位處理)轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上誘導7 d后，其顏色由無色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\色(圖2G)，體積增大。誘導約10 d之后FELB的顏色變?yōu)樯钌?圖2H)，15 d誘導出叢生芽(圖2I)。

在光照條件下，不同質(zhì)量濃度BAP(1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L)均可誘導FELB結(jié)構(gòu)完成胚體萌發(fā)成苗(圖2G—J)。其中，2.0 mg/L BAP的誘導效果最佳，對根、莖、葉外植體所產(chǎn)生FELB結(jié)構(gòu)的胚體萌發(fā)誘導率分別可至29.53%、15.27%、67.07%(表3)。而在黑暗條件下未能成功誘導FELB出苗。

表2 2,4-D對煙草根、莖、葉外植體FELB誘導率的影響 %

注：FELB誘導率是指產(chǎn)生FELB結(jié)構(gòu)的外植體總數(shù)與所有接種的煙草外植體總數(shù)之比。

A．葉片外植體； B．A圖的局部放大，示FELB結(jié)構(gòu)(誘導10 d)； C．離體FELB； D和E．不同發(fā)育階段FELB的醋酸洋紅染色；F．不同發(fā)育階段FELB的形態(tài)； G，H，I和J．FELB的再生誘導； K．FELB再生植株；L和O．再生植株單花和花序； N．再生植株的未成熟果實； M．再生植株的成熟種子圖2 煙草FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)育流程與植株再生

表3 BAP對不同煙草外植體FELB胚體萌發(fā)再生率的影響%

注：FELB胚體萌發(fā)再生率是指發(fā)生胚體萌發(fā)的FELB結(jié)構(gòu)總數(shù)與所有進行胚體萌發(fā)再生的煙草FELB總數(shù)之比。

2.3 FELB結(jié)構(gòu)的組織細胞學分析

煙草FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)生發(fā)育流程主要歷經(jīng)2個重要標志階段，即球形胚(圖3C)和心形-魚雷過渡胚(圖3D)。在FELB的發(fā)生過程中，最先誘導出來的是透明狀的特殊愈傷組織，其結(jié)構(gòu)比較疏松，致密性差(圖3A)。隨著愈傷組織的增多，致密的細胞快速分裂區(qū)(FCDZ，即Fast-cell-division zone)[4]開始出現(xiàn)，F(xiàn)ELB的細胞組成比較密集、緊湊(圖3B、C)。通過冷凍切片觀察和分析，發(fā)現(xiàn)FELB起源于葉片的薄壁組織(圖3D)，屬于內(nèi)起源發(fā)育方式。

A和B.FELB早期結(jié)構(gòu)，示FELB細胞快速分裂區(qū)(FCDZ)，bar=250 μm； C.FELB發(fā)育中期(球形胚)，bar=500 μm； D.FELB發(fā)育后期(心形-魚雷過渡胚)，bar=750 μm圖3 煙草FELB結(jié)構(gòu)不同發(fā)育階段的冷凍切片

3 結(jié)論與討論

在煙草FELB的誘導發(fā)生過程中，黑暗條件與2,4-D(10 mg/L)能夠高頻誘導出大量特殊的愈傷組織與FELB結(jié)構(gòu)，而添加不同濃度NAA的培養(yǎng)基，以及光照條件下的所有2,4-D和NAA處理組均未能誘導出FELB結(jié)構(gòu)。由此認為，合適的生長素類物質(zhì)與濃度、避光是誘導煙草FELB成功的關鍵因素。并且，葉片的特殊愈傷組織與FELB產(chǎn)率最高，根次之，莖最少，這說明同一受體植物材料的不同外植體對相同誘導條件的反應不盡相同。在光照條件下，添加BAP(2.0 mg/L)的培養(yǎng)基可以高效地啟動FELB再生成苗；但是，黑暗條件下，因缺失光的參與，致使無法啟動煙草FELB胚體萌發(fā)的形態(tài)建成。這與之前研究龍葵、蔊菜FELB結(jié)構(gòu)的胚體萌發(fā)誘導結(jié)果是一致的，合適的光照處理與一定濃度的細胞分裂素誘導是FELB胚體萌發(fā)成苗的關鍵因素[3,5]。

煙草FELB的發(fā)生發(fā)育和再生過程可以簡單概述為：外植體—愈傷組織—FELB—成苗。在FELB的誘導發(fā)生過程中，筆者發(fā)現(xiàn)首先誘導出現(xiàn)的是特殊的愈傷組織，其排列比較疏松，細胞核較小，呈黏性和半透明狀態(tài)。繼而，在愈傷組織中逐步形成許多蛙卵狀的胚狀體。愈傷組織為胚狀體的早期發(fā)育提供了水分、營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑等物質(zhì)的共質(zhì)體途徑傳遞與供給，以及保護作用。特別是胚體發(fā)育后期，特殊愈傷組織的逐步減少，為胚體的進一步自我干燥、胚體萌發(fā)提供了良好的外周環(huán)境。FELB發(fā)生部位因其細胞的增殖速度以及新陳代謝旺盛，細胞核較大，染色體豐富，因此易被醋酸洋紅染成淺色。而愈傷組織部分的細胞增殖速度慢，新陳代謝速率不旺盛，細胞核較小，因此會被伊文斯蘭染成深色。筆者在鑒定區(qū)別龍葵[3]、蔊菜[5]等植物的FELB結(jié)構(gòu)與非胚性組織，以及其他胚體結(jié)構(gòu)如栝樓RTB[4]與非胚性組織等研究中，也得了印證。

研究發(fā)現(xiàn)，典型SE結(jié)構(gòu)、蘭科與薔薇屬PLB等體細胞胚結(jié)構(gòu)與煙草FELB結(jié)構(gòu)在誘導發(fā)生方法、發(fā)育流程、胚體萌發(fā)再生等方面均存在較大區(qū)別。比如，多數(shù)植物的SE結(jié)構(gòu)無需培萌再生誘導，其發(fā)育后期可以直接形成萌發(fā)狀態(tài)胚體；狗薔薇(Rosa canina)的PLB[13]結(jié)構(gòu)的發(fā)育流程為：薔薇小葉—愈傷組織—類根體—PLB，并且單個PLB結(jié)構(gòu)可以形成多個獨立單胚，部分可進行自發(fā)胚萌，亦可離體誘導再生。在煙草FELB結(jié)構(gòu)的誘導過程中，其誘導發(fā)生途徑相對簡單、易于分離和便于人為調(diào)控分析。特別是，煙草FELB的發(fā)生誘導與其再生誘導存在著明顯的時空隔離，由兩步法完成。因此認為，煙草FELB結(jié)構(gòu)不同于經(jīng)典SE、蘭科和薔薇屬PLB結(jié)構(gòu)，屬于一種新型的體細胞胚發(fā)生結(jié)構(gòu)。

煙草的轉(zhuǎn)化和再生體系[21]雖然已建立，但因其無菌苗培養(yǎng)等步驟以及轉(zhuǎn)化過程相對比較繁瑣。利用煙草新型體細胞胚FELB可以快速、高效建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系，并由此可以獲得無菌、脫毒材料，為其他茄科植物的再生與轉(zhuǎn)化等相關研究提供了研究思路。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，煙草FELB結(jié)構(gòu)可以進行超低溫保存，鑒于其發(fā)生誘導與再生誘導存在時空隔離，因此構(gòu)建了基于FELB結(jié)構(gòu)的煙草干細胞懸浮培養(yǎng)體系。由于FELB結(jié)構(gòu)的誘導路徑簡單，應用前景廣闊，所以深入研究煙草新型體細胞胚FELB結(jié)構(gòu)的發(fā)生、優(yōu)化其懸浮培養(yǎng)體系，對煙草干細胞生物反應器的實驗室初試、中試模型的構(gòu)建具有很高的理論價值和實踐意義。