袁璽壘，戴凌峰，張小梅，郁飛燕，賈小平

(河南科技大學 農(nóng)學院, 河南 洛陽 471023)

CO(CONSTANS)基因是在擬南芥中克隆的光周期途徑中的關鍵基因，編碼含有2個鋅指結構的蛋白質(zhì)，位于N末端的B-box結構域參與調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用，而且在C末端含有核定位所需要的CCT域[1]。在長日照條件下CO基因通過促進FT基因表達而使開花提前。Hd1是在水稻中克隆的擬南芥CO基因的同源基因，位于第6號染色體，但是其作用方式卻與CO基因不同。Hd1在水稻開花調(diào)控途徑中具有雙重功能，在短日照條件下促進開花，而長日照條件下抑制開花[2-3]。在對其他植物CO基因相關研究中發(fā)現(xiàn)，無論單子葉植物還是雙子葉植物，其CO同源基因都可以互補擬南芥CO基因突變產(chǎn)生的晚花表型，說明單子葉植物和雙子葉植物CO基因在調(diào)控成花方面具有保守性[4]。研究表明，Hd1基因是一個多效基因，除影響作物抽穗期外，還影響株高、穗粒數(shù)等多個農(nóng)藝性狀。如Hd1基因和Ehd1基因可以減少水稻穗部初級分支數(shù)目，使每個穗的小穗數(shù)目減少[5]；構建遺傳背景一致的2個BC2F5群體對水稻RFT1-Hd1a所在區(qū)間、Hd1所在區(qū)間進行QTL分析，發(fā)現(xiàn)這2個區(qū)域都對抽穗期、株高、千粒質(zhì)量有顯著效應，但是Hd1所在區(qū)間作用明顯強于RFT1-Hd1a所在區(qū)間[6]；以珍汕97為輪回親本、密陽46為供體親本的BC2回交組合，構建世代分別為BC2F6和BC2F7的NIL-F2群體和世代為BC2F8的近等基因系群體，這些群體的QTL分析結果表明，在珍汕97遺傳背景下，來自珍汕97的Hd1感光等位基因缺失了光周期敏感性，在自然短日照和長日照下均促進抽穗，并同時降低株高、粒數(shù)和產(chǎn)量[7]。

谷子(SetariaitalicaBeauv.)屬于短日照喜溫作物，對光周期和溫度反應比較敏感是導致其生態(tài)適應性狹窄、生產(chǎn)上缺少跨大區(qū)種植當家品種的重要原因。其中，控制抽穗期的基因?qū)茸由鷳B(tài)適應性有重要作用。目前，谷子全基因組序列已經(jīng)測定，分析表明，谷子抽穗期主要依賴光周期，其中CO基因和Ehd1、Ghd1基因是控制抽穗期的關鍵基因[8-9]。而谷子中水稻Hd1同源基因的相關研究報道極少，近期有學者通過對高粱、水稻、谷子進行比較基因組學研究，發(fā)現(xiàn)在谷子4號染色體存在水稻Hd1基因的同源基因，關聯(lián)分析表明，谷子Hd1中存在一個高頻的從GT到AT的剪接位點變異，該變異導致谷子的生育期變長，Hd1基因在水稻、高粱、谷子中受平行馴化[10]。這是唯一有關谷子Hd1基因的報道，但是該研究沒有闡明谷子Hd1基因是否具有多效性。本研究利用谷子基因組序列信息從11個谷子品種中克隆水稻Hd1基因的同源基因，并且分析其在不同谷子品種間的變異情況，揭示Hd1基因變異與谷子各農(nóng)藝性狀的關系，明確該基因是否具有多效性，同時也為進一步揭示谷子的光周期反應分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

11個谷子品種為豫谷1號、鄭谷2號、鄭8041(14)、濟葉沖4、冀谷1號、安04-5014、龍谷26號、鄭州12、8322-14、法谷28-81、冀谷27。

1.2 農(nóng)藝性狀調(diào)查及分析

谷子材料于2014年種植于河南科技大學周山校區(qū)試驗田，種植方式：每個品種2行，行距30 cm，株距5 cm，行長2 m。于谷子生長期調(diào)查抽穗日數(shù)，抽穗日數(shù)=抽穗期-出苗期；株高、穗長、穗粗、穗質(zhì)量、碼粒數(shù)、穗碼數(shù)、穗粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量，每個品種選中部10株于成熟期及采收后進行性狀測量，性狀測定方法參照文獻[11-13]。用SPSS 18.0軟件進行品種間各性狀差異顯著性檢驗及性狀間相關性分析。

1.3 谷子Hd1-like基因的克隆

采集谷子幼嫩葉片，用常規(guī)的CTAB法提取11個谷子品種基因組DNA，從phytozome 10.0數(shù)據(jù)庫中獲得谷子Hd1-like基因序列(GenBank登錄號：AB807721.1)，用DNAMAN 5.0軟件設計一對特異引物用來擴增包含所有編碼區(qū)、大小為2 340 bp左右的谷子Hd1-like基因序列。引物序列為：正向5′-TGCAAGTGCCAAGCTAAG-3′，反向5′-CCAAGTTCCTTCAAAACCAT-3′。擴增體系25 μL：DNA模板50 ng，引物2.5 pmol/L，擴增 MIX12.5 μL，ddH2O9.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s、51 ℃退火1 min、72 ℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.4 基因突變位點檢測及突變位點與農(nóng)藝性狀關聯(lián)分析

對獲得的Hd1-like基因序列使用多序列比對軟件ClustalX進行多序列比對，尋找突變位點；用TASSEL 2.1軟件進行LD分析及表型性狀與多態(tài)性位點的關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 谷子品種間各性狀差異顯著性分析及性狀間相關性分析

對包括抽穗日數(shù)在內(nèi)的9個性狀進行相關性分析，結果表明，抽穗日數(shù)與株高、穗長、穗粗、穗質(zhì)量、穗粒質(zhì)量存在顯著正相關(P<0.05)，與碼粒數(shù)存在極顯著正相關(P<0.01)；株高與穗碼數(shù)、千粒質(zhì)量存在顯著正相關(P<0.05)，與其他各穗部性狀存在極顯著正相關(P<0.01)；穗長與其他各穗部性狀間存在顯著或極顯著正相關(表1)。

表1 谷子性狀間的相關性分析

注: *表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關; **表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關。

差異顯著性分析結果表明，株高、穗長、穗粗、穗質(zhì)量、穗碼數(shù)、碼粒數(shù)、穗粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量8個農(nóng)藝性狀在11個谷子品種間均存在顯著差異，多數(shù)性狀在品種間存在豐富的變異類型。株高存在極高類型如鄭8041(14)、鄭州12、8322-14、法谷28-81，株高均超過127 cm；較高類型如豫谷1號、鄭谷2號、安04-5014，株高在115～125 cm；中間高度類型如濟葉沖4和冀谷1號，株高在107～113 cm；矮稈品種如龍谷26號和冀谷27號，株高小于70 cm。穗長也存在極長型(大于20 cm)、較長型(15～20 cm)、中間型(10～15 cm)、較短型(小于10 cm)4種類型。其他性狀如穗質(zhì)量、碼粒數(shù)、穗粒質(zhì)量也存在多種變異類型，表明本研究所選的11個谷子品種具有一定代表性(表2)。

表2 8個性狀在11個谷子品種間的差異顯著性檢驗

續(xù)表2 8個性狀在11個谷子品種間的差異顯著性檢驗

注: 同列均值右上角大寫字母不同，表示差異極顯著(P<0.01), 同列均值右上角小寫字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 谷子Hd1-like基因的克隆及序列分析

利用所設計的特異引物從11個谷子品種中均擴增出目標基因片段，大小與預期相符(圖1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測序，11個品種獲得總長為2 351 bp的基因序列。對11條獲得的Hd1-like基因序列進行多序列比對分析，在包含整個編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)內(nèi)共檢測到43個突變位點，這些突變位點均為SNP，沒有發(fā)現(xiàn)Indel。在編碼區(qū)檢測到24個SNP，內(nèi)含子區(qū)檢測到19個SNP(表3)。對檢測到的SNP進行分析，發(fā)現(xiàn)核苷酸突變類型及它們的發(fā)生頻率有所不同，主要為堿基A/G、T/C 2種替換類型(表3)。

N:空白對照； M:DL2000 DNA Marker；1—11：分別表示供試11個谷子品種圖1 11個谷子品種PCR產(chǎn)物電泳檢測結果

表3 Hd1-like基因編碼區(qū)檢測到的SNP位點

注: 帶陰影的位點位于外顯子區(qū)，不帶陰影的位點位于內(nèi)含子區(qū)。

對43個SNP位點進行連鎖不平衡(LD)分析，發(fā)現(xiàn)2個較大的連鎖不平衡結構，均由6個位點組成，第一組包括位點71、1023、1117、1406、1875、2073，只有位點71、2073位于外顯子區(qū)，其余4個位點均位于內(nèi)含子區(qū)域；第二組包括134、185、921、1131、1187、2098，其中位點134和185在外顯子區(qū)，其余4個位點在內(nèi)含子區(qū)(圖2)。

圖2 Hd1-like基因突變位點間的連鎖不平衡分析

根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)中提交的豫谷1號Hd1-like基因CDS序列(Seita.4G122700.1)，對11個谷子品種Hd1-like基因推定的蛋白質(zhì)序列進行了預測，結果發(fā)現(xiàn)，谷子Hd1蛋白和水稻、大麥、小麥等植物同源蛋白具有相似的結構特征，在靠近N端具有典型的鋅指結構，靠近C端具有典型的CCT域(圖3)。對11個推定的Hd1蛋白序列進行多序列比對，共發(fā)現(xiàn)15個氨基酸替換位點，這15個突變位點有2個位于保守的功能區(qū)域，其中第44個氨基酸突變位于鋅指結構區(qū)域，該處氨基酸在10個谷子品種中為酪氨酸，而在鄭州12中則突變?yōu)榘腚装彼?。另一個突變位點位于CCT域，該區(qū)域第334個氨基酸在10個谷子品種中為精氨酸，而在鄭8041(14)中突變?yōu)楦拾彼?圖3)。由于這2個突變均為錯義突變，因此可能造成鄭州12和鄭8041(14)兩個品種對光周期敏感度減弱。

圖3 11個谷子品種間Hd1-like基因推定蛋白質(zhì)序列變異分析

2.3 谷子Hd1-like基因突變位點與主要農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析

關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，有7個多態(tài)性位點與千粒質(zhì)量存在顯著相關，分別為：71、1023、1117、1406、1875、2073、2084，這些位點只有位點71位于編碼區(qū)，剩下的6個位點均位于內(nèi)含子區(qū)，除位點2084外，前面的6個位點均處在一個連鎖不平衡結構中；有一個多態(tài)性位點與抽穗日數(shù)顯著相關，為1165，該位點位于內(nèi)含子中；與株高相關的多態(tài)性位點有2個，分別為1288和2270，其中1288位于內(nèi)含子中，2270位于編碼區(qū)；與穗粗相關的多態(tài)性位點有2個，分別為787和1938，均位于內(nèi)含子中(表4)。

表4 與谷子表型性狀關聯(lián)的突變位點

3 結論與討論

CO基因是植物光周期調(diào)控途徑的關鍵基因，在長日照條件下促進擬南芥開花，而水稻中克隆的CO同源基因Hd1則在長日照條件下通過抑制Hd3a基因的表達而延遲開花。在高粱中，CO同源基因sbCO在缺失sbGhd7和sbPRR37的背景下無論長日照還是短日照均能促進開花[14]。因此，盡管在進化上具有保守性，不同植物之間CO基因的調(diào)控機制存在一定差異。本研究發(fā)現(xiàn)，谷子Hd1基因編碼區(qū)產(chǎn)生的突變類型均為SNP，而無缺失/插入(Indel)類變異。而在水稻的研究中，發(fā)現(xiàn)Hd1基因編碼區(qū)存在的3個插入突變和2個刪除突變與開花時間高度相關[15]。在對高粱和谷子的研究中發(fā)現(xiàn)，Hd1基因編碼區(qū)均存在插入/缺失突變，高粱Hd1基因編碼區(qū)1個5 bp的刪除導致移碼突變，使抽穗期延遲，谷子Hd1基因共存在5處插入/缺失突變，包括1處6 bp的插入/缺失和4處單個堿基的插入/缺失，但是這些突變與抽穗期無關聯(lián)，1個G/A替換導致的可變剪切與抽穗期緊密關聯(lián)[10]。造成本研究未發(fā)現(xiàn)插入/缺失突變的主要原因是谷子材料的選擇，本研究選擇的11個谷子品種全部為栽培種，無野生種，而在Liu等[10]的研究中，選擇的材料除栽培品種外，還包含15個野生品種，分析5處插入/缺失突變發(fā)現(xiàn)，有4處是由于野生種的引入產(chǎn)生的，只有1處單堿基插入突變是栽培品種產(chǎn)生的，因此可以推測，這4處插入/缺失很可能是在野生狗尾草向栽培谷子馴化過程中產(chǎn)生的，它們對野生種向栽培種的轉(zhuǎn)變過程中可能起著某種作用。而1處由栽培品種引起的單堿基插入/缺失在本研究中未被檢測到很可能是樣本量的不同造成的，因為Liu等[10]的研究包含了80多個栽培品種，應該代表更大多樣性，能夠檢出更多的突變位點。盡管本研究選擇的材料有限，只有11個品種，但是在Hd1基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)共檢測到43個SNP位點，表明所選擇的材料間存在較豐富的遺傳變異，具有一定代表性。

CO類基因編碼的蛋白質(zhì)在N末端有含半胱氨酸的鋅指結構：C-X2-C-X16-C-X2-C[16]，而在C末端有一個CCT域。研究表明,只有發(fā)生在這2個區(qū)域的變異才會導致CO基因功能的改變[1]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hd1蛋白在11個谷子品種間存在15個氨基酸替換位點，但是只有2個替換分別發(fā)生在鋅指結構區(qū)和CCT域，1個是第44個氨基酸由酪氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，突變品種為鄭州12，1個是第334個氨基酸由精氨酸突變?yōu)楦拾彼?，突變品種為鄭8041(14)。因為這2個突變均為錯義突變，可能會導致蛋白質(zhì)功能的改變，推測鄭州12和鄭8041(14)對光周期敏感性會減弱。而筆者于2015年、2016年在海南、洛陽、吉林3個不同光周期地區(qū)對包含鄭州12和鄭8041(14)的203個谷子品種抽穗期的調(diào)查結果均表明，鄭州12具有較弱的光周期敏感性，但鄭8041(14)對光周期較敏感(未發(fā)表數(shù)據(jù))，說明Hd1蛋白鋅指結構區(qū)域的突變對其功能有重要影響，而CCT域包含核定位序列，如果突變發(fā)生在該序列，導致不能進行準確的核定位，則會導致基因功能缺失。鄭8041(14)并沒有對光周期表現(xiàn)弱的敏感性，說明CCT域的突變位點可能沒有發(fā)生在核定位序列內(nèi)。

除影響抽穗期外，光周期途徑的許多基因還對其他農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響，具有多重效應。如Ghd7基因除影響開花期外，還影響每穗粒數(shù)[17]。Hd1基因和Ehd1基因可以減少水稻穗部初級分支數(shù)目，使每個穗的小穗數(shù)目減少[5]。Hd1基因所在區(qū)間除對抽穗期有影響外，還對株高和千粒質(zhì)量有顯著作用[6]。近期的研究還表明，Hd1感光等位基因缺失了光周期敏感性，在自然短日照和長日照下均促進抽穗，并同時降低株高、粒數(shù)和產(chǎn)量[7]。目前的研究僅表明，谷子Hd1基因與抽穗日數(shù)緊密相關，而在谷子中該基因是否表現(xiàn)多效性尚沒有報道。本研究通過Hd1基因與9個農(nóng)藝性狀的初步關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，該基因除了與抽穗日數(shù)關聯(lián)外，與千粒質(zhì)量也存在明顯關聯(lián)，同時還與株高和穗粗相關，表現(xiàn)多效性，與在水稻中的研究結果[6-7]存在一定吻合，這表明不同植物CO基因在功能上具有相似性。由于本研究所用的谷子材料有限，因此要想更充分證明Hd1基因的功能，在今后的進一步研究中需要擴大品種數(shù)量，獲得更多的表型變異類型，充分發(fā)掘Hd1-like基因存在的突變，以使關聯(lián)結果更可靠。

通過調(diào)查11個谷子品種抽穗日數(shù)、株高、穗長、穗粗、穗質(zhì)量、碼粒數(shù)、穗碼數(shù)、穗粒質(zhì)量、千粒質(zhì)量9個農(nóng)藝性狀，對除抽穗日數(shù)之外的8個性狀進行品種間差異顯著性檢驗表明，所有8個性狀在11個谷子品種間均存在顯著差異，株高、穗長、穗質(zhì)量等多數(shù)性狀存在豐富的變異類型。對所有9個性狀進行相關性分析表明，株高、抽穗日數(shù)與多數(shù)穗部性狀存在顯著或極顯著正相關，而穗部各性狀是構成谷子產(chǎn)量的重要因子。因此，株高和抽穗日數(shù)對谷子產(chǎn)量潛能具有重要影響。首次克隆了11個谷子品種的Hd1-like基因序列，序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)存在43個變異位點，且都為SNP，未發(fā)現(xiàn)插入/缺失突變；推定的Hd1蛋白序列在11個谷子品種間檢測到15個氨基酸替換位點，其中2個替換發(fā)生在保守的鋅指區(qū)域和CCT結構域，而鋅指結構區(qū)的突變可能導致了鄭州12對光周期敏感性減弱。初步進行了突變位點與農(nóng)藝性狀的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)谷子Hd1-like基因為一個多效基因，除了與抽穗日數(shù)、千粒質(zhì)量存在關聯(lián)，還與株高、穗粗存在關聯(lián)。