李 燕，謝 勇，楊發(fā)輝

（1.重慶市水產(chǎn)科學(xué)研究所，重慶 江北 400020；2.重慶市榮昌區(qū)農(nóng)業(yè)委員會(huì)，重慶 榮昌 402460）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）和青魚（Mylopharyngodon peters）合稱四大家魚，是我國主要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類［1，2］，在西南地區(qū)前3種的產(chǎn)量和消費(fèi)量更大，因肉質(zhì)鮮嫩，價(jià)格便宜成為內(nèi)陸群眾水產(chǎn)品的首選。目前它們的養(yǎng)殖技術(shù)成熟［3－5］、養(yǎng)殖規(guī)模大、價(jià)格便宜。目前對(duì)它們營養(yǎng)成分的研究較少，研究面較窄，且用高效液相色譜儀檢測(cè)的較少，本試驗(yàn)檢測(cè)了四大家魚中鰱魚、鳙魚、草魚的營養(yǎng)價(jià)值。

氨基酸的檢測(cè)方法有離子交換色譜法［6－8］、高效液相色譜法［9－15］、氣相色譜法［16］、毛細(xì)管電泳法［17］等，目前國標(biāo)檢測(cè)方法所用的是氨基酸分析儀離子交換色譜法，但高效液相色譜儀因使用范圍廣，價(jià)格較氨基酸分析儀便宜，很多機(jī)構(gòu)和學(xué)者也在嘗試用高效液相色譜儀檢測(cè)水產(chǎn)品中的氨基酸含量，本試驗(yàn)建立了用高效液相色譜儀的紫外檢測(cè)器（DAD）和熒光檢測(cè)器（FLD）檢測(cè)氨基酸的方法，該方法操作簡(jiǎn)單，試劑用量少，準(zhǔn)確度高，可為其他科研或檢測(cè)機(jī)構(gòu)檢測(cè)氨基酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司，配紫外和熒光檢測(cè)器；BT25S型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DHG－90HA型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市科瑞儀器有限公司。

17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：濃度為1 nmol/μL，每支1 mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院。

鄰苯二甲醛（OPA）、9－芴甲基氯甲酸酯（FMOC）、硼酸緩沖液均為進(jìn)口分裝好的試劑，密度分別為10 mg/mL、0.78 g/mL 和 1.00 g/mL（pH=10.2），可直接使用。

磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉均為分析純，成都市科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈均為進(jìn)口色譜純，霍尼威爾。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 取1 mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水反復(fù)潤(rùn)洗盛裝標(biāo)準(zhǔn)品的安培瓶，洗液合并倒入容量瓶?jī)?nèi)，定容至10 mL，配制成100 nmol/mL的混標(biāo)。再配制濃度為100、80、50、25、10 nmol/mL的混標(biāo)，4℃保存。

1.2.2 樣品的制備 取魚肌肉勻漿，105℃烘干（恒重法）研磨成粉，過40目篩，稱取約30 mg干樣于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的鹽酸溶液，用氮?dú)獯祾? min，水解管連接到真空泵上，抽氣10 min，放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)110±1℃水解24h。水解完后用12mL 6 mol/L的氫氧化鈉中和至弱堿性，定容至25 mL，待測(cè)。

1.2.3 色譜條件 試驗(yàn)建立了能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和樣品溶液的自動(dòng)衍生化過程。自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣設(shè)置見文獻(xiàn)［18］。

流動(dòng)相 A：40 mmol/L 的 Na2HPO4，pH 7.8（稱取6.2 g NaH2PO4·2H2O 定容至 1 L，用 6 mol/L 的氫氧化鈉調(diào) pH 至 7.8）；流動(dòng)相 B∶乙腈∶甲醇∶水=45∶45∶10。 色譜柱：Eelipse－AAA 色譜柱，4.6 mm×150 mm，5 μm。二極管陣列檢測(cè)器 （DAD）和熒光檢測(cè)器（FLD）。DAD 波長(zhǎng)設(shè)置：0～16 min，檢測(cè)波長(zhǎng)為 338 nm，10 nm帶寬，參比 390 nm，20 nm 帶寬；16 min后檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，16 nm帶寬，參比324 nm，8 nm帶寬；峰寬都為 0.1 min。 FLD 波長(zhǎng)設(shè)置：0～15.5 min，激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，增益10；15.5 min后激發(fā)波長(zhǎng)為266 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為305 nm，增益9；峰寬都為0.2 min。柱溫40℃。梯度洗脫條件見表1，流速2 mL/min。

表1 梯度洗脫條件

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制濃度為 100、80、50、25、10 nmol/mL 的 17種氨基酸混標(biāo)，同時(shí)用DAD和FLD進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，17種氨基酸均能被DAD檢測(cè)，線性相關(guān)系數(shù)在 0.9985～0.9999；除半胱氨酸外的其他 16 種氨基酸均能被 FLD 檢測(cè)，線性相關(guān)系數(shù)在 0.998 1～0.999 9；線性關(guān)系均較好，標(biāo)準(zhǔn)品的DAD譜圖和FLD譜圖見圖1和圖2，各氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)見表2。

圖1 17種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的DAD圖譜

圖2 16種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的FLD圖譜

表2 各氨基酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.2 重現(xiàn)性、檢出限和定量限

用5 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液連續(xù)進(jìn)樣6次，F(xiàn)LD檢測(cè)器檢測(cè)，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示儀器的重現(xiàn)性。

當(dāng)各氨基酸的信噪比為3時(shí)，以此時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度或質(zhì)量為檢出限，本試驗(yàn)用10 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)液來測(cè)定DAD檢測(cè)器的檢出限，用1 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)液來測(cè)定FLD檢測(cè)器的檢出限。

當(dāng)各氨基酸的信噪比為10時(shí)，以此時(shí)的濃度為定量限，本試驗(yàn)的定量限由檢出限換算而得。

對(duì)比DAD檢測(cè)器和FLD檢測(cè)器的檢出限，F(xiàn)LD的檢出限和定量限都更低；FLD能檢測(cè)1 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)樣，譜圖效果較好，能清楚地區(qū)分各個(gè)峰；DAD檢測(cè)器能檢測(cè)10 nmol/mL的氨基酸混合標(biāo)樣，譜圖效果較好。各種氨基酸的重現(xiàn)性、檢出限、定量限的數(shù)據(jù)如表3所示。

表3 檢出限、定量限和重現(xiàn)性

2.3 樣品分析結(jié)果

鰱魚、鳙魚、草魚的氨基酸水解液經(jīng)檢測(cè)后，17種氨基酸含量以DAD的檢測(cè)結(jié)果來統(tǒng)計(jì)，必需氨基酸含量以FLD和DAD檢測(cè)結(jié)果的平均值來統(tǒng)計(jì)（圖3至圖8、表4）。結(jié)果表明，鰱魚的氨基酸總量為145.46 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的35.75%；鳙魚的氨基酸總量為 127.49 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的34.67%；草魚的氨基酸總量為124.10 mg/g，其中必需氨基酸占總氨基酸的36.24%。

3 小結(jié)與討論

經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知色氨酸需要堿水解［19］后才能檢測(cè)，本試驗(yàn)用的是酸水解方法，因此文中未涉及色氨酸的檢測(cè)數(shù)據(jù)，但該上機(jī)檢測(cè)方法同樣適用于色氨酸。樣品放入鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)水解前，抽真空要足夠長(zhǎng)（每個(gè)樣品至少抽5 min），并要防止漏氣，如水解后消解用的鹽酸體積變小，有可能是漏氣，會(huì)使檢測(cè)結(jié)果偏低。

圖3 鰱魚樣品的FLD檢測(cè)結(jié)果

圖5 鳙魚樣品的FLD檢測(cè)結(jié)果

圖6 鳙魚樣品的DAD檢測(cè)結(jié)果

圖7 草魚樣品的FLD檢測(cè)結(jié)果

圖8 草魚樣品的DAD檢測(cè)結(jié)果

表4 鰱魚、鳙魚、草魚的氨基酸含量 （單位：mg/g）

目前用高效液相色譜儀檢測(cè)半胱氨酸都是在紫外條件下檢測(cè)［20］，主要是因?yàn)榘腚装彼嵫苌髮?duì)熒光的吸收差，不能用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，因此本試驗(yàn)中FLD也只能檢測(cè)17種混標(biāo)中的16種氨基酸。試驗(yàn)所用高效液相色譜儀配備的自動(dòng)進(jìn)樣器能實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣時(shí)自動(dòng)吸取樣品和衍生試劑完成柱前衍生化過程，在衍生過程中，標(biāo)液或樣品、OPA、FMOC的體積比為1∶1∶1，硼酸鹽緩沖液是為了將樣品調(diào)節(jié)為弱堿性，水和乙腈的作用是洗針和稀釋的作用。試驗(yàn)嘗試不用自動(dòng)進(jìn)樣器衍生化，采用人工衍生化，按照自動(dòng)進(jìn)樣器相同的比例精確地取0.5 mL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，0.5 mL OPA，0.5 mL FMOC 和 2.5 mL 硼酸鹽緩沖液，混合均勻后用精密pH試紙測(cè)pH在9左右，呈弱堿性。上機(jī)檢測(cè)結(jié)果表明17種氨基酸都能檢出，但重現(xiàn)性較自動(dòng)進(jìn)樣器差，且所消耗的標(biāo)準(zhǔn)品和衍生試劑較多。

采用氨基酸柱，以磷酸氫二鈉、甲醇、乙腈、水為流動(dòng)相，建立了OPA－FMOC試劑聯(lián)用柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品同時(shí)用DAD和FLD檢測(cè)，在26 min內(nèi)17種氨基酸能較好的分離。樣品在兩個(gè)檢測(cè)器上的檢測(cè)結(jié)果相差很小，在判定必需氨基酸含量時(shí)取兩個(gè)檢測(cè)結(jié)果的平均值。結(jié)果表明，鰱魚、鳙魚和草魚肌肉內(nèi)至少含有17種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸比例分別為35.75%、34.67%、36.24%，與孔保華等［21］、姜啟興等［22］、王雪峰等［23］所報(bào)道結(jié)果基本一致。