邢 龍 李 楊 馬小龍 MOHAMMED H 黃 瑩 謝富強 * 馮正虎

（1．西北民族大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)國家民委重點實驗室，甘肅 蘭 州 730030；2．西北民族大學(xué)甘肅省口腔疾病研究重點實驗室/培育基地，甘肅蘭州 730030；3．蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730000；4．蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅蘭州 730030）

舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是頭頸部高發(fā)的惡性腫瘤之一，具有男性、年齡大者高發(fā)的特征，全世界每年新發(fā)約300萬例，5年生存率低于50%，煙酒是其主要危險因素[1-3]。目前，癌癥的治療方法以包括手術(shù)、放射和化學(xué)治療的綜合治療為主，手術(shù)仍是TSCC治療的基礎(chǔ)，輔助個性化放療方案和多種化療藥物的聯(lián)合治療方案，能夠改善患者的生活質(zhì)量，延長生命[4]。

新型有機硒化合物乙烷硒啉(BBSKE)是由北京大學(xué)藥學(xué)院研發(fā)的國家一類抗腫瘤新藥，目前正處于臨床Ⅰ期研究，其藥物作用靶點為硫氧還蛋白還原酶[5]。目前，相關(guān)研究結(jié)果顯示硫氧還蛋白及其還原酶與多種腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展有關(guān)，并且在舌鱗狀細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)過表達(dá)[6]。乙烷硒啉在對腫瘤有明顯生長抑制作用的同時，能夠增強放射治療的敏感性，聯(lián)合用藥可降低耐藥性、提高藥效[7-8]。本文將乙烷硒啉體外作用于舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞系，觀察其抗腫瘤細(xì)胞生長的效果，并探討其可能的抗癌機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人口腔舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞系受贈于上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室；乙烷硒啉粉劑購于北京大學(xué)藥學(xué)院；DMEM高糖型培養(yǎng)基購于Gibco公司；胎牛血清購于BI公司；胰蛋白酶購于Sigma公司；四甲基噻唑藍(lán)(MTT)試劑、青鏈霉素混合液和結(jié)晶紫粉劑均購于Solarbio公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒購于BD公司；Hoechst 33258染色液購于MCE公司；Transwell小室購于Contar公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制 將BBSKE粉劑溶于DMSO，配制成20 mmol/L母液，用含有10%血清的培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度藥物(含1‰ DMSO)，以培養(yǎng)基含有1‰ DMSO和10%血清的細(xì)胞為溶劑對照組，以培養(yǎng)基只含10%血清的細(xì)胞為正常對照組。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人舌鱗癌CAL27細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每日觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)目、培養(yǎng)基的顏色和透明度，1～2 d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長至匯合度為70%～80%時傳代。傳代前用0.25%的胰蛋白酶消化，至細(xì)胞變圓變小后，傾去胰蛋白酶，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，分瓶后重新置于原培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。采用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.3 MTT檢測CAL27細(xì)胞增殖活力 取濃度為5×104/mL的對數(shù)生長期CAL27細(xì)胞，接種于96孔板，每孔加100 μL細(xì)胞懸液，孵育過夜。實驗組分別加入2、5、10、20 μmmol/L的BBSKE，各組分別培養(yǎng)24、48、72 h，終止培養(yǎng)后PBS清洗一遍，加入含有10%血清的培養(yǎng)基100 μL，每孔加10 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取孔內(nèi)液體，每孔加100 μL DMSO，置搖床低速振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測定吸光度D(490)值。增殖抑制率=[D(490)對照組- D(490)實驗組] /[D(490)對照組- D(490)空白組]×100%。依據(jù)測算的抑制率，應(yīng)用SPSS軟件Probit回歸分析計算各時間點的IC50值。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CAL27細(xì)胞凋亡率 收集濃度為2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用24 h的CAL27細(xì)胞以及對照組細(xì)胞，PBS重懸，細(xì)胞終濃度至少為1.0×106/mL，離心后加入緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC標(biāo)記，室溫避光孵育15 min，上機前加入5 μL PI，1 h內(nèi)檢測。實驗結(jié)果判定：無染色細(xì)胞為存活細(xì)胞(左下象限)，Annexin V單染細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞(右上象限)，AnnexinV、PI雙染細(xì)胞為晚期凋亡或壞死細(xì)胞(右下象限)，PI單染細(xì)胞為機械性損傷細(xì)胞(實驗操作過程誤差，左上象限)，流式細(xì)胞儀計量測得各象限細(xì)胞比率，以-x±s表示。

1.2.5 CAL27細(xì)胞周期檢測 收集經(jīng)2、5、10、20 μmol/L BBSKE作用24 h后的CAL27細(xì)胞和對照組細(xì)胞，置離心管，PBS重懸細(xì)胞，細(xì)胞終濃度至少為1.0×106/mL，離心后加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化乙錠(PI)，100 μg/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min后上機檢測，單次獨立實驗重復(fù)3次，應(yīng)用Flowjo 7.6.1分析各濃度細(xì)胞周期比率，以x-±s表示。

1.2.6 Hoechst 33258免疫熒光染色檢測CAL27細(xì)胞凋亡 取5.0×105/mL的CAL27細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待貼壁后分別加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE作用12 h，對照組不作處理，作用后棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛4℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸盡固定液，加入10倍稀釋的Hoechst 33258染色液室溫孵育10 min，PBS洗2次，超凈臺中避光風(fēng)干，封片后，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Transwell小室CAL27細(xì)胞遷移實驗 取5.0×105/mL的無血清CAL27細(xì)胞懸液接種于Transwell小室內(nèi)，下室分別加入2、5、10、20 μmol/L的BBSKE，對照組下室加入含10%血清的培養(yǎng)基，上下室內(nèi)培養(yǎng)12 h，用棉簽棒擦盡上室殘余細(xì)胞，下室用4%多聚甲醛4 ℃固定10～20 min，去固定液，PBS洗2次，吸盡固定液，加入結(jié)晶紫染色液室溫孵育10 min，PBS洗2次，超凈臺中避光風(fēng)干，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，每個樣本隨機采集5張圖片，計數(shù)遷移細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x-±s 表 示。各藥物濃度處理組與正常對照組指標(biāo)差異的分析采用單因素方差分析，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗分析不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞系增殖抑制率的影響

MTT實驗結(jié)果見表1，CAL27細(xì)胞在各作用時間隨藥物濃度的增加，其腫瘤細(xì)胞增殖抑制率逐漸增加；在同一濃度的BBSKE作用下，抑制率隨作用時間的增加而增加。BBSKE作用24、48、72 h對CAL27細(xì)胞系增殖抑制的IC50分別為(48.0±2.2)、(13.8±1.4)、(3.2±0.6) μmol/L。

表1 不同濃度BBSKE作用不同時間后對CAL27細(xì)胞增殖抑制率的影響-(%，x±s)

2.2 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞凋亡率的影響

Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果見圖1和表2，可見與對照組比較，隨著BBSKE藥物濃度的增加，CAL27細(xì)胞凋亡的比例隨之增加。濃度為5、10、20 μmol/L的BBSKE處理后的早期凋亡率明顯增加(P＜0.01)，濃度為10、20 μmol/L的BBSKE處理后的晚期凋亡率明顯高于對照組(P＜0.01)。

表2 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞凋亡率的影響(%，-x±s)

圖1 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞凋亡的影響

2.3 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

通過免疫熒光染色檢測不同濃度BBSKE作用后的CAL27細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，實驗結(jié)果見圖2，可見2 μmol/L組細(xì)胞鏡下與對照組無明顯差異，未見細(xì)胞凋亡改變；5、10 μmol/L組相比對照組細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞質(zhì)固縮，染色質(zhì)濃縮成半月狀附著于核膜，鏡下可見凋亡小體；20 μmol/L組則細(xì)胞數(shù)較少，見整個凋亡細(xì)胞濃染。

圖2 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響

2.4 不同濃度BBSKE對細(xì)胞系CAL27細(xì)胞周期的影響

采用Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度BBSKE作用24 h后的CAL27細(xì)胞，結(jié)果見圖3和圖4，可見濃度為10和20 μmol/L時G2/M期比例明顯升高，與對照組相比存在顯著差異(P＜0.01)，出現(xiàn)G2/M期阻滯。

2.5 不同濃度BBSKE對細(xì)胞系CAL27細(xì)胞遷移的影響

結(jié)果見圖5和圖6，我們發(fā)現(xiàn)隨著BBSKE濃度的增加，穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)逐漸減少，這說明BBSKE對人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞遷移有明顯的抑制作用。

3 討論

口腔癌中，針對舌鱗狀細(xì)胞癌的各種治療手段均存在并發(fā)癥風(fēng)險，諸如手術(shù)治療后患者出現(xiàn)舌功能障礙，放化療導(dǎo)致骨髓移植、黏膜炎、脫發(fā)等影響患者的生存率和生活質(zhì)量[9]。近些年靶向治療被認(rèn)為是治療癌癥的新策略，一些前沿技術(shù)的研究如伽馬刀射線、基因治療、靶向細(xì)菌療法能夠獲得較好的治療效果[10-12]，同時將酶作為重要的藥物作用靶點，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡也是抗癌藥物研發(fā)的主要途徑之一。乙烷硒啉靶向硫氧還蛋白還原酶有著良好的抗腫瘤作用，但目前對于口腔癌的研究仍不多，我們將BBSKE作用于人舌癌CAL27細(xì)胞，觀察到CAL27細(xì)胞藥物作用后的細(xì)胞增殖被抑制，Annexin V-FITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光技術(shù)等也顯示細(xì)胞周期的改變和細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度BBSKE作用于CAL27細(xì)胞24 h后對細(xì)胞周期的影響

圖4 不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞周期的影響

我們的研究通過體外培養(yǎng)人舌鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞系，初次將不同濃度的BBSKE作用于人舌癌CAL27細(xì)胞，觀察該藥物對腫瘤細(xì)胞生長活性的影響，實驗結(jié)果顯示：CAL27細(xì)胞在各作用時間隨藥物濃度的增加，其腫瘤細(xì)胞生長抑制率逐漸增加；在同一濃度BBSKE作用下，抑制率隨時間增加，具有劑量依賴性和時間依賴性。Xing等[13]之前的研究將乙烷硒啉體內(nèi)和體外作用對舌癌Tca8113細(xì)胞系，能夠顯著降低TrxR的表達(dá)活性，促進(jìn)凋亡信號因子Caspase-3的表達(dá)升高，抑制腫瘤細(xì)胞生長。這些研究結(jié)果均提示BBSKE在用于治療人舌鱗狀細(xì)胞癌方面具有潛在能力。

圖5 光學(xué)顯微鏡下觀察不同濃度BBSKE對CAL27細(xì)胞系細(xì)胞遷移的影響

-圖6 不同濃度BBSKE作用CAL27細(xì)胞后的細(xì)胞遷移數(shù)量(x±s)

細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤轉(zhuǎn)化在抗癌機制研究中扮演重要角色，細(xì)胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤發(fā)生和腫瘤失控性增殖的誘發(fā)因素，這個過程是由于一些例如p53抑癌基因失活導(dǎo)致細(xì)胞周期監(jiān)察點功能缺陷，引發(fā)各種錯誤進(jìn)入周期，如損傷的DNA進(jìn)入細(xì)胞周期，產(chǎn)生基因突變等的基因不穩(wěn)定現(xiàn)象，使細(xì)胞周期驅(qū)動機制強化[14]。細(xì)胞凋亡是一個受復(fù)雜調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過程，是包含細(xì)胞正常更新、免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能、激素依賴性萎縮、胚胎發(fā)育和化學(xué)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的重要組成[15-16]。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，其各自傳導(dǎo)過程中的信號因子在兩個過程中都起著重要作用，細(xì)胞凋亡可發(fā)生于細(xì)胞周期的各個階段，細(xì)胞周期調(diào)控成分的突變可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞增殖失控，這取決于誘導(dǎo)藥物和細(xì)胞的類型，例如抗癌藥物紫杉醇使人唾液腺腺樣囊性癌ACC-2細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17-18]。本課題組使用Annexin VFITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測BBSKE對人舌癌CAL27細(xì)胞周期的結(jié)果發(fā)現(xiàn)G0/G1期比例在濃度為5、10、20 μmol/L的BBSKE作用后降低，G2/M則隨濃度的增加比例逐漸升高，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期(見圖4、圖5)。在 BBSKE濃 度 為 5、 10、 20 μmol/L時 Annexin VFITC/PI染色流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光染色結(jié)果可見CAL27細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞核染色質(zhì)固縮濃染，出現(xiàn)凋亡改變(見圖2、圖3)；同時，隨著濃度的增加凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，與對照組相比存在顯著差異(P＜0.01)。Shi等[20]將BBSKE作用于前列腺癌細(xì)胞后能夠明顯抑制其生長，同時出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯于S期和細(xì)胞凋亡[19]。 Fu等[20]體外細(xì)胞實驗將BBSKE單獨或聯(lián)合順鉑作用于人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其單獨作用可將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，聯(lián)合順鉑可以逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的G2/M期阻滯，從而降低順鉑的耐藥性，提高藥效。本實驗MTT實驗結(jié)果測得各時間的半數(shù)抑制濃度(IC50) 隨著BBSKE作用時間增加，其IC50逐漸減小，這表明BBSKE隨作用時間的增加，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力越強(見表2)。我們的實驗結(jié)果及上述相關(guān)研究結(jié)果表明，乙烷硒啉能夠通過某些機制調(diào)控細(xì)胞周期，誘導(dǎo)不同周期階段的阻滯，從而誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，達(dá)到癌癥治療的目的，同時聯(lián)合其他抗癌藥物的藥效更佳。

單細(xì)胞的遷移實驗是體外研究細(xì)胞運動的最佳方法，能夠為體內(nèi)許多生理運動過程的研究提供依據(jù)，例如腫瘤轉(zhuǎn)移的評估[21-22]。Transwell小室細(xì)胞遷移實驗是衡量細(xì)胞遷移能力較好的實驗方法，在不同濃度BBSKE作用下，CAL27細(xì)胞的遷移數(shù)量與藥物濃度呈反比(見圖7)，該結(jié)果說明BBSKE能夠影響CAL27 細(xì)胞遷移能力，抑制TSCC腫瘤轉(zhuǎn)移。

根據(jù)以上結(jié)果表明，BBSKE對TSCC具有較好的抗腫瘤作用，其抗腫瘤的機制可能為通過某些信號因子將腫瘤細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，從而誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞凋亡，使癌細(xì)胞死亡；同時，BBSKE具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，降低癌癥復(fù)發(fā)率。相似的研究僅對BBSKE誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機制，通過凋亡信號因子的傳導(dǎo)進(jìn)行研究，本文首次從體外分析了BBSKE對人舌癌細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果提示其抗腫瘤的潛在機制可能與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白存在相關(guān)性，其具體的信號傳導(dǎo)機制尚需進(jìn)一步實驗研究。因此，新型有機硒化合物乙烷硒啉能夠作為TSCC患者化療治療的備選藥物，本研究為其臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。