齊雪松，王春燕，李 辰 ，佟 鵬，邵 帥，曲功霖，茍 巧 ，蘇 旭*

（中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學所，輻射防護與核應急中國疾病預防控制中心重點實驗室，北京 100088）

細胞微絲對細胞生物學各個方面都有影響，參與細胞的運動、物質運輸、能量轉換、信息傳遞、細胞分化等一系列重要功能[1]。絲切蛋白(cofilin)可促進微絲解離，抑制單體肌動蛋白聚合，最終引起微絲骨架改變[2]。在哺乳動物細胞中存在3種絲切蛋白家族成員，即肌動蛋白聚合因子(actin depolymerizing factor，ADF)、cofilin 1和cofilin 2。其中ADF和cofilin 1主要存在于非肌肉細胞中，cofilin 2主要存在于肌肉細胞中，cofilin 1比ADF在肌動蛋白成核過程和剪切過程起著更重要的作用[3]。cofilin 1蛋白廣泛存在于靜息細胞的胞質中，一旦細胞活化，它會出現(xiàn)在細胞膜運動的邊緣，參與微絲骨架的高速組裝和細胞移動[4]。cofilin 1在機體組織中的表達水平不盡相同，在神經(jīng)系統(tǒng)、腸道、腎臟和睪丸中表達較高，在造血組織、破骨細胞和成纖維細胞中也有較高表達[5-6]。有研究報道，cofilin 1在胃癌細胞中過表達，促進細胞骨架重排，誘導上皮間質轉化[7]。下調LIMK1-ADF/cofilin可抑制結腸癌的轉移和侵襲[8]。當γ射線誘導小鼠胸腺淋巴細胞時發(fā)現(xiàn)微絲隨照射劑量增大而損傷加重，cofilin基因表達隨照射劑量的增大而上調[9]。這些結果表明cofilin的表達變化對細胞的功能狀態(tài)發(fā)揮著重要調節(jié)作用。

淋巴細胞是機體免疫系統(tǒng)的主要參與者，同時具有較高輻射敏感性，大劑量電離輻射時，外周血淋巴細胞的急性損傷嚴重，是醫(yī)療救治的難點。因此，本項目擬通過觀察γ射線誘導BALB/c小鼠胸腺淋巴細胞的微絲形態(tài)變化和對cofilin蛋白磷酸化的影響，探討cofilin及相關蛋白在輻射損傷中的作用，為臨床救治提供實驗依據(jù)及探索新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SPF級BALB/c小鼠，60只，雄性，4～6周齡(北京維通利華)，實驗動物許可證號SCXK(京)2011-0039。SPF級動物房飼養(yǎng)，自由飲水，觀察無異常后進行實驗。將36只小鼠隨機分為6組，分別為對照組(0 h組)、照后3、6、9、12和24 h組，除對照組外，其他組給予2 Gy γ射線照射，于照后各時間點頸椎脫臼處死小鼠，解剖取出胸腺，用吸滿0.01 mol/L PBS溶液的1 mL注射器(美國BD公司)將胸腺中的淋巴細胞沖出，離心收集細胞。通過cofilin基因mRNA和蛋白的表達檢測，確定適宜的取材時間。再將另24只小鼠隨機分為4組，分別為未照射(0 Gy)組、2、6和10 Gy組，除未照射組外，其他組給予不同劑量的γ射線照射，于前述確定的適宜時間取材，進行cofilin蛋白、磷酸化cofilin蛋白(phosphorylated cofilin，p-cofilin)、LIM激酶1 (LIM domain kinase 1，LIMK1)、TES激酶2(testicular protein kinase 2，TESK2)和Slingshot家族的磷酸酶2 (slingshot phosephatase 2，SSH2)蛋白表達檢測。

1.2 照射條件

分別將小鼠裝進照射盒內，劑量率為0.3 Gy/min，60Co γ射 線 (新 華 FCC-7000A)全 身 一 次 均 勻 照 射 ， 2 Gy照射時間約為400 s，6 Gy照射時間約為1 200 s，10 Gy照射時間約為2 000 s。

1.3 熒光雙標法觀察微絲形態(tài)

用4%多聚甲醛(美國Sigma Aldrich公司)固定收集的小鼠胸腺淋巴細胞，加入300 μL 0.2% Triton-X 100，室溫靜置5 min，離心棄上清。加入200 μL 0.5% BSA，室溫靜置10 min，離心棄上清。加入FITC-鬼筆環(huán)肽(Phalloidin，美國Sigma Aldrich公司，針對actin微絲蛋白)和Alex Fluor 594連接的脫氧核糖核酸酶I (美國Invitrogen公司)，終濃度均為5 μg/mL，混勻、孵育，離心棄上清。用0.01 mol/L PBS 1 mL清洗2次，調整細胞濃度約為104～ 105/mL?；靹颍?0 μL細胞懸液滴片，并用含有DAPI的抗熒光淬滅劑(美國Vector公司)封片。激光共聚焦顯微鏡觀察胸腺細胞微絲的形態(tài)變化。

1.4 采用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)檢測cofilin mRNA的表達水平

Trizol法提取小鼠胸腺淋巴細胞總RNA，取1 μL總RNA原液，用紫外可見分光光度計NANODROP 2000(美國Thermo Fisher公司)直接檢測，讀取D(260)/D(280)比值和濃度值，各組總RNA D(260)/D(280)值在1.78～2.02范圍內，符合實驗要求。以各組總RNA為模板，按GoScript反轉錄體系(美國Promega公司)說明書進行cDNA合成。以GAPDH為內參基因，cofilin為目的基因，SYBR染料法(美國Invitrogen公司)檢測小鼠胸腺細胞中cofilin mRNA表達水平。

1.5 Western blot檢測蛋白表達

取經(jīng)BCA法定量的蛋白樣品25 μg，與5×蛋白上樣緩沖液(上海生工)混勻，置于沸水中加熱5 min，使蛋白質變性。迅速放入冰中冷卻，離心后SDSPAGE電 泳 ， PVDF膜 (美 國 Millipore公 司 )轉 膜 ， 5%

B

SA封 閉 (上 海 生 工 )， 分 別 用 cofilin、 p-cofilin、LIMK1、TEST2、SSH2和GAPDH一抗孵育，4 ℃過夜，二抗孵育，室溫1 h(抗體均購自美國CST公司)，滴加發(fā)光液(美國Santa Cruze公司)，用ChemiDoc XRC+成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad 公司)拍攝條帶圖像。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

用2-ΔΔCT法對qPCR結果進行相對定量分析，用成像分析系統(tǒng)測量Western blot條帶的灰度值，內參蛋白為GAPDH，將目的蛋白與內參蛋白進行灰度值對比校正，得到蛋白的相對表達量。用SAS 9.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，方差齊的數(shù)據(jù)進行方差檢驗，方差不齊的數(shù)據(jù)進行秩和檢驗。

2 結果

2.1 γ射線誘導小鼠胸腺淋巴細胞不同時間cofilin基因表達的變化

由于2-ΔΔCT法要求目的基因與內參基因的擴增效率一致，因此根據(jù)cDNA濃度梯度的log值(X)和ΔCT值 (Y)，求出兩者的線性關系，Y=8.2+0.092X，斜率為0.092，接近于0，說明cofilin基因與GAPDH基因擴增效率一致，可用2-ΔΔCT法對cofilin基因mRNA表達的進行相對定量分析。

經(jīng)方差齊性檢驗，各組數(shù)據(jù)方差齊(F=2.40、1.67、0.12，P＞0.05)，可用于方差分析。圖1A可見，與對照組(0 h組)比較，cofilin基因mRNA表達在照后24 h內，除12 h組外，其余各時間組均呈明顯的下調趨勢(P＜0.05)。cofilin蛋白表達在照后3和9 h組呈明顯降低(t=2.58、3.04，P＜0.05)，其他組變化并不明顯，見圖1C。p-cofilin蛋白表達變化趨勢與cofilin蛋白相似，但與0 h組比較各組差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。考慮cofilin基因表達在照后3 h明顯下調，且為最早出現(xiàn)變化的時間點，因此選擇照后3 h為后續(xù)實驗取材時間。

圖1 2 Gy γ射線誘導小鼠胸腺淋巴細胞24 h內的cofilin基因表達和p-cofilin蛋白表達變化

2.2 不同劑量γ射線誘導小鼠胸腺淋巴細胞微絲形態(tài)的變化

激光共聚焦顯微鏡下觀察，未照射的胸腺淋巴細胞質纖維形肌動蛋白(fibrous actin，F(xiàn)-actin，綠色標記)清晰可見、排列緊密、形態(tài)完整、邊緣光滑、顏色明亮、球形肌動蛋白 (globular actin，G-actin，紅色標記)彌散且均勻分布于胞質中，細胞核(藍色標記)顏色較淡。2、6和10 Gy γ射線誘導后3 h，細胞的F-actin含量隨照射劑量增大而逐漸減少，細胞核明顯，有的細胞中可見F-actin疏松的絲狀排列或斷裂的F-actin小體。G-actin分布不均勻，呈團塊狀聚集(圖2)。

2.3 不同劑量γ射線誘導BALB/c小鼠胸腺淋巴細胞cofilin和p-cofilin蛋白表達的變化

2、6和10 Gy γ射線誘導3 h后取材，與0 Gy組比較，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加，各照射組cofilin蛋白表達量逐漸上調，其中10 Gy組上調差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而p-cofilin的表達隨射線劑量的增加而下調，其中10 Gy組下調有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(圖3)。這表明，隨著照射劑量的增加，p-cofilin蛋白表達量減少，cofilin蛋白表達量增高，引起F-actin快速解聚，抑制G-actin的聚合，淋巴細胞的遷移能力增強。

圖2 不同劑量γ射線誘導小鼠胸腺淋巴細胞微絲形態(tài)的變化

2.4 不同劑量γ射線對cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶表達的影響

如圖4所示，磷酸化酶LIMK1蛋白和TESK2蛋白表達隨γ射線劑量增大而小幅下調。去磷酸酶SSH2蛋白的表達隨γ射線劑量增大而增高，但差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖4 不同劑量γ射線誘導胸腺淋巴細胞cofilin磷酸化酶和去磷酸化酶蛋白表達的變化

3 討論

cofilin蛋白的活性主要由其Ser3位點磷酸化與否進行調控，LIMK和TESK為主要的磷酸化酶，使Ser3位點磷酸化，cofilin蛋白失活，不能與肌動蛋白絲結合，提高了F-actin的穩(wěn)定性；SSH為主要的去磷酸化酶，使Ser3位點去磷酸化，激活cofilin蛋白，使其能夠與F-actin結合，促進肌動蛋白絲的解聚[10]。由此可見，cofilin的磷酸化進程是肌動蛋白解聚的開關。cofilin可結合G-actin，參與去組裝過程，是去組裝過程中不可或缺的蛋白，但磷酸化的cofilin與G-actin的親和性顯著降低[11]。對人結腸癌發(fā)生進程的研究發(fā)現(xiàn)，LIMK/cofilin通路上的LIMK1、LIMK2和SSH2的過表達與結腸癌的進程及其化學抗藥性相關，并有望成為結腸癌治療中的腫瘤標志物和治療靶標[12]。在腦型瘧疾研究中發(fā)現(xiàn)，LIMK1/cofilin1通路的失調，使得神經(jīng)細胞的樹突形態(tài)發(fā)生改變，形成了actin-cofilin小體[13]。這些研究顯示了LIMK/cofilin通路在疾病研究中的重要性，但在電離輻射誘導的損傷機制研究中相關的報道并不多見。

本研究檢測了γ射線誘導BALB/c小鼠胸腺淋巴細胞cofilin 1、p-cofilin、LIMK1、TESK2和SSH2蛋白表達的變化，發(fā)現(xiàn)隨著照射劑量的增加，cofilin 1的表達有增加的趨勢，而p-cofilin的表達則減少，磷酸化酶LIMK1和TESK2的表達小幅下調，但去磷酸化酶SSH2的表達呈上調趨勢，因此可推測，隨著照射劑量的增加，更多的SSH2使p-cofilin的Ser3位點去磷酸化，這使得細胞質中cofilin 1的含量增多，參與到微絲骨架組裝的過程中，并能使淋巴細胞進入活躍狀態(tài)，其遷移能力增強，行使各項功能，以增強對射線的抵抗能力。但2 Gy γ射線誘導，隨著時間的延長，cofilin 1 和p-cofilin的含量均減少，這可能是細胞內貯存的pcofilin受損或消耗過多，cofilin 1供應不足，淋巴細胞的活化能力降低，輻射敏感性增強。當上調腦膠質瘤細胞U251的cofilin蛋白表達，U251的輻射抗性顯著增強，下調cofilin蛋白表達后，U251的遷移能力和輻射抗性均降低[14]。肝癌細胞也有類似的表現(xiàn)，當pcofilin表達的增多可以使肝癌細胞的遷移能力降低[15]。Jurkat T細胞的研究中發(fā)現(xiàn)SSH基因沉默會降低細胞的遷移和活化[16]。

放射治療中的免疫細胞降低一直是影響療效的首要副作用[17]，其產(chǎn)生的機制并未探明。雖然已有一些防治措施，但療效未達預期。從微絲的角度探討免疫細胞輻射敏感的機制研究正逐漸成為熱點，并具有潛在的臨床應用價值。本研究對電離輻射誘導微絲改變的機制進行了初步摸索，發(fā)現(xiàn)了一些變化規(guī)律，提出假設，進一步驗證工作亟待深入。