劉濱，殷學(xué)偉，郭勵(lì)劼，丁紅燕，畢宏生，郭大東,*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島266109 3. 淮陰工學(xué)院，江蘇省介入醫(yī)療器械研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮安 223003 4. 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所，濟(jì)南 250002

目前，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的納米材料已在基因轉(zhuǎn)染[1-2]、疾病診斷[3-4]、藥物傳輸[5-6]等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。由于缺乏系統(tǒng)評(píng)估，納米材料對(duì)生物體的風(fēng)險(xiǎn)及對(duì)人類(lèi)身體健康的潛在影響仍然是一個(gè)值得關(guān)注的問(wèn)題。

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)ZnO納米材料能對(duì)生物發(fā)揮潛在的遺傳毒性[7-9]。ZnO納米粒子釋放到水生生態(tài)系統(tǒng)中，能夠通過(guò)當(dāng)?shù)睾凸I(yè)廢水對(duì)魚(yú)類(lèi)和其他生物產(chǎn)生有害的影響[10]，其遺傳毒性與ROS水平升高[11]、鈣穩(wěn)態(tài)的失衡[12]、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路如絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[13]、caspase依賴(lài)的信號(hào)通路[14]等的激活有關(guān)。然而，ZnO納米粒子引起細(xì)胞毒性的作用機(jī)制仍不十分清楚。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)一種重要的細(xì)胞器，在電子傳遞、線(xiàn)粒體跨膜電位、氧化磷酸化以及ROS的產(chǎn)生和清除[15]等活動(dòng)中起重要的作用。過(guò)量的ROS會(huì)促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放、引起caspase激活，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷或細(xì)胞死亡[16]。ATP依賴(lài)的Na+/K+-ATP酶可通過(guò)ATP水解提供能量，保持細(xì)胞內(nèi)外Na+和K+梯度，對(duì)維持細(xì)胞膜電位和正常細(xì)胞的生理功能具有重要作用[17-18]。其中，由atp1a1基因編碼的Na+/K+-ATP酶亞型被認(rèn)為在所有細(xì)胞中均表達(dá)[19-21]，由atp1b2基因編碼的Na+/K+-ATP酶亞型主要表達(dá)于不同的神經(jīng)細(xì)胞以及視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞[22-23]。通過(guò)Na+/K+-ATP酶調(diào)節(jié)Na+和K+梯度對(duì)維持膜電位和細(xì)胞電興奮性至關(guān)重要[18, 24]，Na+/K+- ATPase的功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞離子梯度的喪失，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。

研究證實(shí)，視網(wǎng)膜在感光終端區(qū)具有較高水平的鋅離子，并對(duì)調(diào)節(jié)谷氨酸釋放、維持光感受器細(xì)胞功能發(fā)揮作用[25]。細(xì)胞毒作用研究表明，ZnO納米粒子能破壞正常的細(xì)胞[26]，如人晶狀體上皮細(xì)胞[27]、肺上皮細(xì)胞[28]、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[14]和小鼠感光細(xì)胞的生理功能，其機(jī)制與鈣離子(Ca2+)、自噬、凋亡、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)降低TGF-β和MMP-9的表達(dá)，ZnO納米粒子可以抑制小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的增殖和遷移[26]，并可抑制超氧化物歧化酶(MnSOD)的表達(dá)和活性[29]。在本研究中，我們進(jìn)一步觀察了ZnO納米粒子對(duì)661W細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，探討其對(duì)小鼠光感受器細(xì)胞的LDH、Δφm、ROS水平、鉀離子通道以及Na+/K+-ATP酶的表達(dá)及其活性影響，有助于理解ZnO納米粒子引起細(xì)胞毒作用的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 ZnO納米粒子及其溶液的制備

ZnO納米粒子購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司，純度大于99.7%；661W細(xì)胞由美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)健康衛(wèi)生中心Muayyad教授惠贈(zèng)。ZnO納米粒子經(jīng)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行表征，其粒徑分布范圍為15到50 nm，平均粒徑為30 nm[30]。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

661W細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(DMEM，Life Technology，美國(guó))中，并添加1 g·L-1的葡萄糖，10%胎牛血清(Hyclone公司，美國(guó))，100 μg·mL-1鏈霉素和100 U·mL-1青霉素，并培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中由自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(TC10，Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.3 LDH釋放檢測(cè)

使用LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，上海)檢測(cè)了ZnO納米粒子與661W細(xì)胞共培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中LDH的釋放水平。661W細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)接種于6孔板中在37 ℃包含孵化器5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，然后細(xì)胞與不同濃度的ZnO納米粒子(分別為0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)共培養(yǎng)24 h，然后取不同處理?xiàng)l件下的細(xì)胞上清培養(yǎng)基120 μL用于LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)。檢測(cè)試劑盒在室溫下反應(yīng)30 min。以不含ZnO納米粒子培養(yǎng)的661W細(xì)胞上清液作為陰性對(duì)照。所有的實(shí)驗(yàn)操作程序都按照試劑供應(yīng)商的操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

通過(guò)流式細(xì)胞儀(Accuri C6，美國(guó))并使用2，7′- dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA，Invitrogen公司，美國(guó))測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的水平變化。小鼠光感受器細(xì)胞(5×105細(xì)胞/孔)接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜，然后用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子分別共培養(yǎng)6 h。收獲細(xì)胞并用冷PBS溶液洗滌2次后，細(xì)胞用DCFH-DA溶液(10 μmol·L-1)懸浮，然后在黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)30 min，再用PBS漂洗，漂洗結(jié)束后30 min內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。在每個(gè)樣品的檢測(cè)中，收集2×104細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)計(jì)數(shù)分析。

1.5 線(xiàn)粒體膜電位分析

Δφm是維持細(xì)胞正常的生理?xiàng)l件所必需的。通常用5,5'，6,6'- tetrachloro-1,1′,3,3′-四乙基苯并咪唑基碳菁碘(JC-1)在細(xì)胞線(xiàn)粒體中積累總量(其熒光紅色)以及在細(xì)胞質(zhì)中的單體(其熒光綠色)變化進(jìn)行檢測(cè)。細(xì)胞凋亡早期的Δφm下降或消失，JC-1不能積聚在線(xiàn)粒體并消散為JC-1單體導(dǎo)致紅色熒光的消失[18]。因此，紅色熒光響應(yīng)線(xiàn)性增加膜電位[31]。在本研究中，利用JC-1探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Δφm的水平變化(碧云天生物技術(shù)研究所，南通)。661W細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，分別用0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子孵育6 h。然后0.25%胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，PBS洗2次，再用JC-1探針溶液孵育(37 ℃)30 min，在黑暗條件下，用冷PBS洗滌2次，最后，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定Δφm(BDVerse，BD Biosciences公司，美國(guó))。

1.6 全細(xì)胞膜膜片鉗測(cè)定

電壓依賴(lài)性鉀離子(K+)通道(Kv)可以使鉀離子穿過(guò)細(xì)胞膜引起膜電壓的變化，并通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)作電位的形狀和頻率調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的興奮性，從而具有生理和病理生理的影響[32]。本研究中，我們利用port-a-patch Nanion芯片系統(tǒng)(epc-10，Heka，Nanion，德國(guó))在室溫(25 ℃)條件下進(jìn)行全自動(dòng)膜片鉗實(shí)驗(yàn)。膜片鉗實(shí)驗(yàn)前將661W細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板。實(shí)驗(yàn)時(shí)用PBS沖洗細(xì)胞，分離暴露在0.25%含1 mmol·L-1EDTA的胰蛋白酶中。用不同濃度(即0、31.25、62.5和125 μmol·L-1)ZnO納米粒子培養(yǎng)5 min后，用細(xì)胞膜片鉗測(cè)定延遲整流鉀電流的變化情況。用電解質(zhì)溶液有以下成分：細(xì)胞外液含10 mmol·L-1NaCl, 75 mmol·L-1CsCl, 2 mmol·L-1MgCl2, 70 mmol·L-1CsF, 10 mmol·L-1Hepes/KOH, pH 7.2；細(xì)胞內(nèi)液含10 mmol·L-1KCl, 75 mmol·L-1NaCl, 70 mmol·L-1NaF, 2 mmol·L-1MgCl2, 2 mmol·L-1CaCl2, 5 mmol·L-1D-glucose monohydrate, 2 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1Hepes/NaOH, pH 7.4。去極化電位為+40 mV的-80 mV的鉗制電位測(cè)定的延遲整流鉀電流。patchmaster軟件(Nanion，德國(guó))用來(lái)記錄延遲整流鉀電流。

1.7 Na+/K+-ATP酶mRNA表達(dá)水平分析

661W細(xì)胞(2×105細(xì)胞/孔)接種于6孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后采用不同濃度(分別為0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)ZnO納米粒子孵育661W細(xì)胞2 h，經(jīng)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總RNA，然后根據(jù)試劑盒的操作步驟，用Trizol試劑提取細(xì)胞661W的總RNA(艾德萊生物科技有限公司，北京)。首先用600 ng總RNA合成單鏈cDNA，然后以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。引物序列見(jiàn)表1，Q-PCR程序設(shè)置如下：95 ℃ 5 min，其次是95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用各自的內(nèi)源GAPDH控制后使用2ΔΔCT方法進(jìn)行歸一法處理[33]。

表1 PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物Table 1 Primers in amplification of target genes by quantitative PCR

圖1 ZnO納米粒子對(duì)細(xì)胞形態(tài)和661W細(xì)胞釋放LDH的影響注：*P<0.05, **P<0.01，與對(duì)照比較。Fig. 1 Effects of ZnO nanoparticles on cell morphology and LDH release in 661W cellsNote: Scale bar = 20 μm；*P<0.05, **P<0.01, compared with control.

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞和不同濃度的ZnO 納米粒子共培養(yǎng)24 h后ROS水平注：*P<0.05, **P<0.01，與對(duì)照比較。Fig. 2 ROS levels of 661W cells after exposure to different concentrations of ZnO nanoparticles for 24 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

1.8 細(xì)胞內(nèi)Na+/ K+-ATP酶表達(dá)和活性分析

661W細(xì)胞(4×105細(xì)胞/孔)接種于6孔培養(yǎng)板中于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱里過(guò)夜，后棄去上清液，再使用不同濃度(分別為0、31.25、62.50和125 μmol·L-1)的ZnO納米粒子繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用0.25%含1% EDTA的胰蛋白酶溶液消化收集細(xì)胞、離心，用冷PBS懸浮細(xì)胞團(tuán)洗滌細(xì)胞2次。再用0.5 mL冷PBS懸浮細(xì)胞團(tuán)，在冰上超聲處理10 min后5 000 g離心10 min，收集上清溶液，進(jìn)行蛋白定量，然后用ELISA試劑盒檢測(cè)100 μL上清中小鼠Na+/ K+-ATP酶的蛋白水平含量。實(shí)驗(yàn)方法按照試劑盒供應(yīng)商的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行(武漢基因美生物科技有限公司，武漢)。此外，Na+/K+-ATP酶活性(每個(gè)樣品為50 μL)使用Na+/K+-ATP酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定(南京建成生物工程研究所)。使用紫外可見(jiàn)雙光束分光光度計(jì)(4802S UV/VIS，尤尼科(上海)有限公司)在636 nm處測(cè)定吸光度值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD(標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用One-way ANOVA的Newman-Keuls檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果(Results)

2.1 LDH釋放度的測(cè)定

圖1顯示小鼠光感受器細(xì)胞在與不同濃度的ZnO納米粒子培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照樣品(即細(xì)胞培養(yǎng)于不含ZnO納米粒子的溶液中)細(xì)胞形態(tài)和LDH釋放曲線(xiàn)。圖中看出，661W細(xì)胞暴露于ZnO納米粒子溶液24 h導(dǎo)致LDH釋放到培養(yǎng)基中的水平明顯升高，并且LDH在培養(yǎng)基中的釋放水平增加與細(xì)胞中ZnO納米粒子的培養(yǎng)濃度密切相關(guān)。

2.2 細(xì)胞內(nèi)ROS水平的測(cè)定

661W細(xì)胞分別于0、31.25、62.5和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子共培養(yǎng)6 h后，ROS的產(chǎn)生從1.8%±0.35%分別上升到31.7%±2.74%, 43.8%±2.97%和61.5%±5.36%(圖2)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)基中ZnO納米粒子濃度的增加，ZnO納米粒子誘導(dǎo)的ROS水平也隨之升高，表明ROS的產(chǎn)生依賴(lài)于細(xì)胞中ZnO納米粒子的培養(yǎng)濃度。此外，ZnO納米粒子誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS與對(duì)照樣品產(chǎn)生的ROS相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3 線(xiàn)粒體膜電位的改變

ZnO納米粒子溶液與661W細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后，紅色熒光強(qiáng)度明顯下降。如圖3所示，經(jīng)31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液處理細(xì)胞6 h后，小鼠光感受器細(xì)胞的Δφm從94.6%±1.2%分別下降到83.5%±1.6%, 75.1%±2.3% 和 64.3%±1.7%，證實(shí)ZnO納米粒子溶液處理可對(duì)661W細(xì)胞的Δφm產(chǎn)生明顯下調(diào)作用。

2.4 延遲整流外向鉀電流的抑制作用

如圖4所示，小鼠光感受器細(xì)胞具有較大的延遲整流外向鉀電流。然而，在細(xì)胞經(jīng)不同濃度的ZnO納米粒子處理后，細(xì)胞的延遲整流鉀電流均表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，并且呈濃度依賴(lài)性，即越高的ZnO納米粒子與靶細(xì)胞共培養(yǎng)，則會(huì)導(dǎo)致延遲整流鉀電流越小。

2.5 Na+ / K+-ATP酶表達(dá)水平的下降

用不同濃度的ZnO納米粒子培養(yǎng)661W細(xì)胞后，我們分別用實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及ELISA對(duì)細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATP酶的mRNA和蛋白水平進(jìn)行了檢測(cè)。圖5A顯示在經(jīng)31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液培養(yǎng)細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATP酶Atp1a1 的mRNA水平下降到正常對(duì)照組細(xì)胞水平的45.7%、 62.5% 和 33.6%，同時(shí)Atp1b2的mRNA水平下降到正常對(duì)照水平的19.2%、31.9% 和26.8%，對(duì)照組與處理組的mRNA表達(dá)水平有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

利用ELISA方法，我們還檢測(cè)了661W細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATP酶與不同濃度的ZnO納米粒子共培養(yǎng)6 h后蛋白質(zhì)水平的變化。圖5B顯示了細(xì)胞暴露于不同濃度的ZnO納米粒子后Na+/K+-ATP酶的表達(dá)水平變化情況。我們觀察到小鼠光感受器細(xì)胞內(nèi)Na+/K+-ATP酶的蛋白水平從15.03 pg·mg-1分別降低到11.88、10.77和9.81 pg·mg-1，并具有濃度依賴(lài)性。

圖3 不同濃度的ZnO納米粒子處理6 h后661W細(xì)胞Δφm變化注：*P<0.05, **P<0.01，與對(duì)照比較。Fig. 3 Alterations of Δψm in murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticles for 6 hNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

2.6 Na+ / K+-ATP酶活性降低

細(xì)胞經(jīng)31.25、62.50和125 μmol·L-1的ZnO納米粒子溶液處理后，Na+/K+-ATP酶的活性與未經(jīng)處理的661W細(xì)胞Na+/K+-ATP酶的活性相比均有明顯的下降。如圖6所示，ZnO納米粒子處理可顯著降低Na+/K+-ATP酶的活性。我們發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶活性從0.428下降到0.302、0.344和0.324 U ·mg-1，證實(shí)ZnO納米粒子溶液的處理可顯著抑制Na+/K+-ATP酶的活性。

3 討論(Discussion)

研究表明，ZnO納米粒子具有明顯的細(xì)胞毒作用，其作用機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)[11]。Fu等[32]發(fā)現(xiàn)，工程納米材料因其尺寸小、高比表面積和高表面反應(yīng)性可產(chǎn)生更高水平的ROS并誘導(dǎo)氧化損傷。暴露于ZnO納米粒子的661W細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的ROS(圖2)。Yoo等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Hela細(xì)胞可通過(guò)吸附和細(xì)胞內(nèi)吞作用將帶正電荷的ZnO納米粒子吸入到細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并產(chǎn)生過(guò)多的ROS，這表明ZnO納米粒子對(duì)ROS的產(chǎn)生具有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用。因此，ROS的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用而造成細(xì)胞損傷，最終誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡或壞死。

已證實(shí)線(xiàn)粒體功能異常是造成Δφm下降的主要原因，可能會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體去極化、致凋亡蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)而參與細(xì)胞凋亡[35]。同時(shí)，線(xiàn)粒體也是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源。因此，Δφm和ROS水平的測(cè)定對(duì)于線(xiàn)粒體功能正常與否提供了參考[36]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，ZnO納米粒子可導(dǎo)致661W細(xì)胞Δφm下降，ZnO納米粒子溶液濃度越高，線(xiàn)粒體膜電位下降越大(圖3)。這一結(jié)果表明，線(xiàn)粒體膜電位的下降是細(xì)胞經(jīng)ZnO納米粒子處理后誘導(dǎo)661W細(xì)胞死亡的關(guān)鍵所在。

圖5 不同濃度ZnO納米粒子處理后Na+/K+ -ATP酶的mRNA和蛋白水平表達(dá)注：*P<0.05, **P<0.01，與對(duì)照比較。Fig. 5 Expressions of Na+/K+-ATPase at mRNA and protein levels after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, conpared with control.

圖6 不同濃度的ZnO納米粒子處理后661W細(xì)胞Na+/K+ -ATP酶活性的測(cè)定注：*P<0.05, **P<0.01，與對(duì)照比較。Fig. 6 Measurement of Na+/K+-ATPase activity of murine photoreceptor cells after treatment with different concentrations of ZnO nanoparticlesNote: *P<0.05, **P<0.01, compared with control.

電壓依賴(lài)性鉀通道可以使膜電位依賴(lài)性K+的選擇性滲透，在維持正常的細(xì)胞的生理狀態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用[37]。Zhao等[38]研究發(fā)現(xiàn)，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，ZnO納米粒子能使大鼠海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元整流鉀電流從20 mV增加到90 mV。電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZnO納米粒子能阻斷電壓依賴(lài)性鉀通道的離子滲透途徑，影響細(xì)胞內(nèi)外鈉離子和鉀離子的交換，從而使細(xì)胞的Δφm下降并破壞細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

Na+/K+-ATP酶對(duì)于維持跨膜離子梯度和基本的細(xì)胞功能及存活至關(guān)重要。本文研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞暴露于ZnO納米粒子可引起LDH水平升高和ROS水平增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生。如果細(xì)胞內(nèi)過(guò)度氧化應(yīng)激不能及時(shí)排除，這將抑制Na+/K+-ATP酶的表達(dá)和活性，擾亂細(xì)胞內(nèi)外離子之間的Na+和K+的交換以及阻斷延遲整流鉀電流和膜電位的平衡，引起細(xì)胞損傷。Sawosz等[39]發(fā)現(xiàn)在雞胚胎發(fā)育的初期注射納米銀為可以增加Na+/K+-ATP酶的表達(dá)，影響細(xì)胞分化；同時(shí)，Bessemer等[40]還透露，淡水魚(yú)暴露在ZnO納米粒子可以增加鰓的Na+/K+ATPase活性，這結(jié)果可能是歸因于上皮通透性增加或結(jié)構(gòu)重塑?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，我們推斷，暴露于納米粒子后的Na+/K+-ATP酶活性的差異可以解釋為暴露于ZnO納米粒子的組織和納米材料的變化。

總之，ZnO納米粒子能明顯促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)LDH釋放到培養(yǎng)基中，提高細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，破壞661W細(xì)胞的Δφm。小鼠感光感受器細(xì)胞暴露于ZnO納米粒子會(huì)降低延遲整流鉀電流和抑制Na+/K+-ATP酶的表達(dá)及其活性，從而破壞細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的平衡，誘發(fā)細(xì)胞死亡，最終表現(xiàn)出ZnO納米粒子對(duì)661W細(xì)胞的毒性作用。我們的研究結(jié)果有助于闡釋ZnO納米粒子介導(dǎo)的鉀離子通道阻滯和Na+/K+-ATP酶抑制引起的小鼠光感受器細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和細(xì)胞毒作用。

致謝：本研究得到了江蘇省介入醫(yī)療器械重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(jr1602)和山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃(2013WS0251)的資助，在此表示感謝。