賀凱宏，尚楠，陳建平，張萍，張玲，牛僑，張勤麗

山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生教研室，太原 030001

目前，納米氧化鋁主要用于制備催化劑載體、分散助劑、粉末涂料和研磨料等而被廣泛應(yīng)用于微電子、制陶業(yè)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，有研究者計劃將納米氧化鋁作為一種用于污水處理的促凝劑和清除有機質(zhì)的重要成分[1]。這些應(yīng)用都可能使納米氧化鋁進入環(huán)境，特別是水生環(huán)境中，可能對水生生物產(chǎn)生潛在的危害[2-3]。已有研究表明，納米氧化鋁對多種水生生物有潛在的毒性，如細菌[4]、藻類[5-6]、大型蚤[7]等，但關(guān)于納米氧化鋁對斑馬魚胚胎及幼魚的神經(jīng)發(fā)育毒性尚未見報道。

神經(jīng)發(fā)育對個體發(fā)育至關(guān)重要，處于發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)較成熟的神經(jīng)系統(tǒng)更加容易受到外源性毒物的作用[8]。已有文獻報道，其他納米顆粒對斑馬魚胚胎及幼魚存在神經(jīng)發(fā)育毒性。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，納米二氧化鈦暴露不影響斑馬魚胚胎和幼魚的孵化率、死亡率和畸形率，但會影響斑馬魚幼魚的運動行為；納米氧化鋅可影響斑馬魚幼魚的孵化率和運動行為[10]。本課題組研究亦證實，孕期暴露納米氧化鋁可影響仔鼠正常的神經(jīng)發(fā)育[11]，提示納米氧化鋁可能會影響斑馬魚幼魚的運動行為。但哺乳動物存在周期長、成本高等局限性，而斑馬魚具有哺乳類動物不具備的優(yōu)點：繁殖周期短、產(chǎn)卵量大且體外受精、胚胎透明、飼養(yǎng)成本低等；除此之外，斑馬魚基因可以更加簡單有效地用于基因重組或者培育轉(zhuǎn)基因斑馬魚[12]。斑馬魚幼魚個體小而透明，幼魚發(fā)育至出生后第5天(5 dpf, day post-fertilization)便可自由游動，可以同時對數(shù)百條幼魚進行運動速度、運動軌跡以及光刺激等行為學(xué)分析，可以更加客觀地評價幼魚的運動行為[13-14]。故本研究以斑馬魚幼魚為研究對象，探討納米氧化鋁對斑馬魚幼魚早期運動行為的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

成年TU野生型斑馬魚購自中國科學(xué)院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心(武漢，中國)；50 nm粒徑氧化鋁(貨號544833-50G)購自美國Sigma公司(分析純)；BCA(貨號CW0014S)蛋白定量試劑盒(北京康為世紀公司)；超氧化物歧化酶SOD(貨號A003-1)、微量丙二醛MDA(貨號A003-1)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

SB25-12DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；VCX150超聲波細胞破碎儀(美國SONICS公司)；spectra MAX M2酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)；nano-ZS90納米粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)；OLYMPUS BX51熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology)；智誠ZXSR-1090彩屏、編程生化培養(yǎng)箱。

實驗用水均為充氧飽和的標(biāo)準胚胎培養(yǎng)液(E3培養(yǎng)液)[15]：5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2和0.33 mmol·L-1MgSO4，不含亞甲基藍，并用NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2左右。用E3培養(yǎng)液逐級稀釋成不同濃度的納米氧化鋁暴露液：12.5、25、50、100 μg·mL-1，超聲處理30 min?？紤]到納米材料易團聚沉淀[16]，暴露液均為當(dāng)天暴露前新鮮配制。

1.2 方法

1.2.1 納米顆粒的表征

用E3培養(yǎng)液配制不同濃度的納米氧化鋁懸液，超聲處理30 min后，用nano-ZS90納米粒度儀檢測納米顆粒的尺寸及電位。

1.2.2 斑馬魚飼養(yǎng)與繁殖

斑馬魚飼養(yǎng)于愛生牌1型5層雙排養(yǎng)殖單元循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫(28±1) ℃，pH值7.2～7.8，電導(dǎo)率500～550 μS·cm-1。光照自動控制，光照/黑暗周期為14 h∶10 h，光照時間為8:30—22:30。斑馬魚每日規(guī)律喂食2次人工孵化的豐年蝦(“七彩魚”牌)幼體。繁殖方法參考文獻[17]進行。

1.2.3 急性毒性試驗

收集受精后6 h(6 hpf, hour post-fertilization)的斑馬魚胚胎于6孔板中，以E3培養(yǎng)液為空白對照組，不同濃度的納米氧化鋁暴露液為染毒組，每組160顆，共8個孔，每孔20顆卵/10 mL試液，染毒液更新周期為1 d。水溫保持在28.5 ℃左右，光照/黑暗周期控制在14 h∶l0 h。以卵凝結(jié)或心臟停跳為死亡終點，記錄受精后144 h的死亡率；分別記錄胚胎受精后48、54、60、72、96 h的孵化率。同時采集染毒時間達到24 h和48 h的斑馬魚胚胎及幼魚圖片。

1.2.4 黑暗狀態(tài)下的運動行為及趨觸性檢測

在顯微鏡下隨機選擇各濃度組外觀正常的受精后6 d(6 dpf, day post-fertilization)幼魚，將其放入24孔板中，24條/組。開啟斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)，參考文獻[18]設(shè)置觀察區(qū)域和檢測程序。采集3 min幼魚運動視頻。用EthoVision XT 10軟件分析視頻，導(dǎo)出運動速度、運動距離、在外區(qū)累計持續(xù)時間百分數(shù)等參數(shù)。

1.2.5 對強光刺激的驚恐逃避反射試驗

隨機選取同批次各濃度組6 dpf幼魚放入24孔板中，24條/組。開啟斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)，設(shè)置觀察區(qū)域和檢測程序。采集7 min幼魚運動視頻。其中前、后3 min無光照，中間1 min(即第4分鐘)突然開啟底座燈強光照射1 min后迅速關(guān)閉。用EthoVision XT10軟件分析視頻，導(dǎo)出各個時間段幼魚運動速度等參數(shù)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 納米氧化鋁的表征

本研究所用納米氧化鋁的表征參數(shù)數(shù)值見表1。

2.2 納米氧化鋁對斑馬魚胚胎的急性毒性

將受精后6 h(6 hpf)的斑馬魚胚胎暴露于不同濃度的納米氧化鋁懸液中，得出各濃度組胚胎/幼魚144 hpf累積死亡率和各時間段胚胎孵化率。與空白對照組相比，孵化率、死亡率均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

由圖1可知，與對照組相比，25、50、100 μg·mL-1納米氧化鋁組胚胎染毒24 h后著色加深，胚胎包膜表面遍布顆粒(見圖1A)；與對照組相比，25、50、100 μg·mL-1納米氧化鋁組染毒48 h后幼魚頭部著色均有加深，以100 μg·mL-1組最為明顯，腦組織著色加深明顯，輪廓已不清晰(見圖1B)。

圖1 納米氧化鋁染毒對斑馬魚胚胎(6 hpf)和幼魚(6 dpf)的毒性影響注：A圖，染毒24 h的斑馬魚胚胎；B圖，染毒48 h的斑馬魚幼魚。Fig. 1 Images of zebrafish embryo (6 hpf) and larvae (6 dpf) after exposure to nano-aluminaNote: A, the zebrafish embryos exposed for 24 h; B, the zebrafish larvae exposed for 48 h.

表1 納米氧化鋁的尺寸和電位Table 1 Size and potential of nano-alumina

2.3 納米氧化鋁暴露對幼魚黑暗狀態(tài)下運動能力及趨觸性程度的影響

圖2為不同濃度納米氧化鋁暴露6 d后幼魚的運動行為及趨觸性行為。與對照組相比，25、50、100 μg·mL-1納米氧化鋁組幼魚的運動速度、運動距離均顯著下降(P<0.05)，幼魚運動行為能力受到抑制(見圖2A和圖2B)。以在外區(qū)累計持續(xù)時間百分數(shù)為指標(biāo)考察幼魚趨觸性程度[18]，50、100 μg·mL-1納米氧化鋁組幼魚趨觸性程度較空白對照組均顯著下降(P<0.01)，表明這2組幼魚觸壁行為減弱(見圖2C)。圖3為各組幼魚的運動行為軌跡圖和熱區(qū)圖。

圖3 不同濃度納米氧化鋁暴露6 d后幼魚運動行為軌跡圖(A)和熱區(qū)圖(B)Fig. 3 The trajectory (A) and heat map (B) of motor behavior of zebrafish larvae after 6 days of exposure to different concentrations of nano-alumina

圖4 納米氧化鋁暴露對幼魚(6 dpf)驚恐逃避反射能力的影響注：A圖，不同濃度納米氧化鋁組幼魚速度隨時間變化圖；B圖，光照1 min時各組幼魚運動速度的變化(mm·s-2)；C圖，光照1 min后各組幼魚運動速度的變化(mm·s-2)。與對照組比較，* P<0.05。Fig. 4 The effect of nano-alumina on panic and avoidance reflection of 6 dpf zebrafish larvaeNote: A, the velocity of larvae in different concentrations of nano-alumina changed with time; B, the accelerated speed during the illumination time of 1 min; C, the accelerated speed of 1 min after the illumination time. Compared with control, * P<0.05.

2.4 納米氧化鋁暴露對幼魚(6 dpf)驚恐逃避反射能力的影響

圖4顯示，各組幼魚在光照1 min內(nèi)運動速度較光照前的黑暗期均明顯下降(P<0.05)(見圖4A)。但25 μg·mL-1和100 μg·mL-1濃度組在光照時速度下降得更慢(P<0.05)(見圖4B)；關(guān)閉光源后，各組幼魚的運動速度都會上升，但25 μg·mL-1和100 μg·mL-1濃度組在關(guān)閉光源后速度上升得更慢(P<0.05)(見圖4C)。這提示幼魚應(yīng)激水平下降。

3 討論(Discussion)

3.1 利用斑馬魚幼魚建立早期運動行為檢測模型

納米氧化鋁可以導(dǎo)致大鼠[19]、小鼠[11]等哺乳動物神經(jīng)行為受損，運動能力下降。但哺乳動物存在周期長、成本高等局限性。而斑馬魚因其獨特的優(yōu)勢而成為一種評價納米毒性的良好動物模型，斑馬魚的行為作為一項敏感指標(biāo)也已成為評價納米毒性水平最重要的參數(shù)，而運動行為又是斑馬魚行為學(xué)中與毒性測試最密切相關(guān)和高度研究的內(nèi)容[20]。Chen等[9]2011年采用斑馬魚幼魚行為軌跡跟蹤系統(tǒng)檢測了納米二氧化鈦對5 dpf斑馬魚幼魚運動行為的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼魚運動行為受損，且運動行為比其他參數(shù)(如孵化率、死亡率等)更敏感。Chen等[10]2014年的研究還發(fā)現(xiàn)高濃度納米氧化鋅(5～10 mg·L-1)亦會影響斑馬魚幼魚的運動行為。未見納米氧化鋁對斑馬魚幼魚運動行為影響的報道。本研究初步建立了24孔板對斑馬魚幼魚早期運動行為研究的評價方法，引入了趨觸性行為。從幼魚早期自發(fā)運動速度、運動距離、趨觸性程度，黑暗條件下自發(fā)運動軌跡和熱區(qū)圖，以及對強光刺激的驚恐逃避反射等，客觀評價了納米氧化鋁對斑馬魚幼魚早期運動行為的影響。

3.2 納米氧化鋁導(dǎo)致斑馬魚幼魚早期運動能力下降

高濃度納米氧化鋁(25、50、100 μg·mL-1)暴露會導(dǎo)致斑馬魚幼魚自發(fā)運動受損，可能與納米顆粒引起魚鰭氧化損傷有關(guān)。趨觸性可反映幼魚的緊張程度[18]，50、100 μg·mL-1納米氧化鋁組幼魚趨觸性下降，幼魚緊張程度降低，懷疑納米氧化鋁透過血腦屏障進入了幼魚腦組織。在6 dpf幼魚對強光刺激的驚恐逃避反射試驗中發(fā)現(xiàn)，25 μg·mL-1和100 μg·mL-1濃度組對強光刺激的驚恐反射能力和強光刺激后的黑暗逃避反射能力均下降，而幼魚的應(yīng)激反射受中樞神經(jīng)系統(tǒng)支配，提示納米氧化鋁可能具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，這與納米氧化鋁具有神經(jīng)毒性[11]的結(jié)論一致?？紤]到納米材料易團聚沉淀[16]，團聚沉淀會使納米顆粒在行為方式上與分散的顆粒表現(xiàn)不同，影響納米顆粒在水環(huán)境中的遷移作用，進而影響納米顆粒的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)。但尚未查到納米顆粒團聚會影響斑馬魚幼魚運動行為的報道，所以納米氧化鋁團聚對斑馬魚幼魚運動行為的影響尚不清楚。但目前有研究表明，納米材料團聚可引起細胞炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[21]。

3.3 納米氧化鋁對多種水生生物有潛在毒性

綜上所述，納米氧化鋁可以影響斑馬魚幼魚早期的運動行為，但納米氧化鋁對幼魚魚鰭的影響及幼魚腦組織中的鋁含量仍待進一步研究。