李文龍，馮永永，李凱彬,*，聶湘平,#

1. 暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生態(tài)系/水生生物研究中心，廣州 510632 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣州 510380

維生素A是一種必需生物活性物質(zhì)，但是動物本身并不能直接合成維生素A。有證據(jù)表明，過量的維生素A對動物體具有一定的毒性[1]。因此，動物大都不能直接喂食維生素A而需要攝食植物來源的維生素A前驅(qū)物質(zhì)，然后在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成維生素A。其中β-胡蘿卜素是較為重要的來源[2]。β-胡蘿卜素-15,15′-加氧酶(β-carotene-15,15′-momoxygenase 1，bco1)是將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為維生素A的關(guān)鍵酶，因此該酶對動物體內(nèi)胡蘿卜素消化吸收、代謝轉(zhuǎn)運(yùn)及動物生長發(fā)育等都有重要影響。它能夠通過對稱性裂解將β-胡蘿卜素在15′,15′鍵位置斷開，生成2分子的全反式視黃醛，最后生成視黃酸或維生素A[3]。在通過用定點(diǎn)誘變替換小鼠bco1酶中保守的組氨酸和酸性殘基以及整個家族中非保守的4個組氨酸和一個谷氨酸來產(chǎn)生突變形式的bco1的研究中發(fā)現(xiàn)，bco1的活性中心由4個完全保守的組氨酸和5個酸性殘基(His172，His237，His308，His514，Asp52，Glu140，Glu314，Glu405和Glu457)組成，此酶必須通過亞鐵離子與4個殘基、水、氧分子連接，組成一個特殊的八面體結(jié)構(gòu)才具有活性，4種保守組氨酸和Glu405中的任何一種產(chǎn)生突變都會導(dǎo)致小鼠bco1活性完全喪失[3-4]。Hessel等[5]在敲除小鼠bco1基因的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，bco1功能的缺失能夠?qū)е戮S生素A缺乏，當(dāng)進(jìn)一步喂食富含β-胡蘿卜素的飼料后，在小鼠的肝臟、肺臟和脂肪組織均有大量的β-胡蘿卜素積累。因此bco1是β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化成維生素A過程中關(guān)鍵酶[6]。

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) 系統(tǒng)，是利用繼鋅指核酸內(nèi)切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)之后第三代人工核酸內(nèi)切酶的基因編輯系統(tǒng)，可用于多種基因組的編輯[7]。該系統(tǒng)最初是細(xì)菌應(yīng)對噬菌體、病毒、質(zhì)?；蚱渌旧w編碼序列等的免疫系統(tǒng)[8]。其原理是通過特定的小分子RNA識別靶向序列，以此導(dǎo)向核酸內(nèi)切酶Cas9結(jié)合到相應(yīng)的位點(diǎn)上，并造成平末端雙鏈缺口。裂解位點(diǎn)通常由錯誤傾向的非同源末端連接(NHEJ)機(jī)制不完全修復(fù)，通過引入插入或缺失導(dǎo)致基因突變。與第一代基因編輯技術(shù)的鋅指核酸酶(ZFN)和第二代基因編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)核酸酶(TALEN)等其他靶向突變工具相比，CRISPR/Cas9的實(shí)驗(yàn)設(shè)計非常簡單快速[7]。目前已有在人類細(xì)胞、斑馬魚[9-12]和小鼠等多種基因組靶向修飾上成功應(yīng)用該技術(shù)的例子。該技術(shù)可以對基因進(jìn)行移碼突變、定點(diǎn)敲入、兩位點(diǎn)同時突變和小片段的缺失等基因修飾。由于其突變效率高、制作簡單及成本低的特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的基因組定點(diǎn)改造分子工具[13]。

斑馬魚(Daniorerio)因其個體小，便于飼養(yǎng)，已作為生物、醫(yī)學(xué)、生態(tài)毒理等多個領(lǐng)域的模式動物被廣泛研究，在環(huán)境毒理及醫(yī)學(xué)等方面研究都有成熟的標(biāo)準(zhǔn)方法[14-17]。斑馬魚繁殖快，單次產(chǎn)卵數(shù)量多，而且卵期的胚胎全透明，可以十分便捷地觀察整個胚胎發(fā)育過程。以斑馬魚受精卵作為胚胎急性毒性暴露實(shí)驗(yàn)已成為一種公認(rèn)的檢測物質(zhì)毒性的有效方法，不僅與成魚毒性試驗(yàn)有較好的對應(yīng)關(guān)系，而且更為敏感，并且能夠完善成魚實(shí)驗(yàn)無法實(shí)現(xiàn)的有關(guān)發(fā)育影響的研究[18-19]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚的與bco1編碼相關(guān)的bco1和bco1l基因，并且通過多代遺傳獲得具有可遺傳突變類型的個體，為深入開展對斑馬魚bco1的功能研究、以及后續(xù)對bco1和bco1l基因兩者功能與關(guān)系的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斑馬魚Tuebingen(Tu)品系野生型由珠江水產(chǎn)研究所提供；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；質(zhì)粒pXT7-Cas9和pMD-gRNA由北京大學(xué)的熊敬維與張博教授提供[20-21]。超微量基因型鑒定YSY Buffer(南京堯順禹生物科技有限公司)；Golden Easy PCR System (TIANGEN)；凝膠電泳回收試劑盒Gel Extraction Kit D2500-02(Omega)；PCR產(chǎn)物回收試劑盒(Axgen)；gRNA用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒MAXIscript?T7 Kit(Ambion)；Cas9 mRNA及yfp-nanos3 mRNA用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒T7 mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion)，加尾試劑盒Poly (A) Tailing Kit(Ambion, AM1350)；RNA純化試劑盒RNease Mini kit T4104(Qiagen)；基因型檢測用載體pMDTM18-T Vector Cloning Kit(TaKaRa)；PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 查找序列

在基因組序列數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁http://asia.ensembl.org/中搜索斑馬魚bco1與bco1l相關(guān)基因信息，包括核苷酸序列、基因組結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的保守功能結(jié)構(gòu)域等。根據(jù)所得該基因信息選定其中涉及所有轉(zhuǎn)錄本的外顯子一段序列，特別是要優(yōu)先選擇編碼蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域的外顯子及靠近上游的外顯子。根據(jù)所選片段設(shè)計檢測引物并進(jìn)行驗(yàn)證，確定可以擴(kuò)增出所需片段，確定能夠設(shè)計多個sgRNA識別位點(diǎn)以保證檢測到有效的sgRNA。

1.2.2 CRISPR的設(shè)計與合成

在CRSIPR設(shè)計網(wǎng)頁http://crispr.mit.edu/中輸入選定的序列，可得到所有可用的CRISPR序列以及相應(yīng)的評分。選取合適位點(diǎn)的CRISPR序列作為檢測對象，在選取的CRISPR序列前方添加T7啟動子序列TAATACGACTCACTATA及識別堿基G(如所設(shè)計CRISPR序列起始堿基即為G，可不加)，后方添加部分骨架序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGC(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成設(shè)計的DNA片段)，然后以合成DNA片段作為正向引物及骨架通用反向引物PRgRNA: 5′AAAAAAAGCACCGACTCGGT 3′，以pMD-gRNA質(zhì)粒作為模板，用PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara)通過PCR擴(kuò)增出轉(zhuǎn)錄所需DNA片段，PCR反應(yīng)條件為35×(98 ℃、10 s; 55 ℃、5 s; 72 ℃、5 s); 4℃保存，各成分用量按照說明書確定。用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳確定目標(biāo)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)過無RNA酶污染的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳確定目標(biāo)片段；再以純化產(chǎn)物為模板，用MAXIscript?T7 Kit轉(zhuǎn)錄成RNA，加入無RNA酶污染的醋酸鈉至體系(pH=5.2)，再加入無RNA酶污染的無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)為70%，置于-20 ℃過夜。過夜沉淀后體系在4 ℃、12 000 g條件下離心20 min，棄上清；以70%無RNA酶污染的無水乙醇清洗沉淀，再在4 ℃、12 000 g條件下離心20 min，棄上清，加10L DEPC-H2O溶解沉淀，取2L以2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以確定目標(biāo)片段，并用微量分光光度計(OD 1000, One drop)測定濃度，備用。

1.2.3 Cas9 mRNA與yfp-nanos3 mRNA的合成

Cas9 mRNA與yfp-nanos3 mRNA則在各自的質(zhì)粒以EcoRI、HindIII酶，在37 ℃下酶切過夜后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳確定目標(biāo)片段，經(jīng)過無RNA酶污染的PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收，再由無RNA酶污染的T7 mMESSAGE mMACHINE Kit轉(zhuǎn)錄，并用無RNA酶污染的Poly (A) Tailing Kit進(jìn)行帶帽加尾，用無RNA酶污染的RNA純化試劑盒RNease Mini Kit T4104純化后，用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳確定目標(biāo)片段并用微量分光光度計(OD 1000, One drop)測定濃度，備用。

1.2.4 顯微注射

于注射前一天把野生親本以雌：雄為1:2的比例放置到產(chǎn)卵缸內(nèi)，并且以隔板隔開，黑暗養(yǎng)殖8 h以上。注射當(dāng)天早上拉開隔板，待野生親本產(chǎn)卵后，于Ⅰ-細(xì)胞期內(nèi)，將Cas9 mRNA調(diào)整到300 ng·L-1，與yfp-nanos3 mRNA、sgRNA各0.5L混勻進(jìn)行顯微注射。

1.2.5 sgRNA活性檢測

在顯微注射后的12 h至24 h之間，在熒光顯微鏡下挑選5個能觀察到黃色熒光的魚卵，制備基因組DNA模板，以各自目標(biāo)片段檢測引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；35×(94 ℃、30 s; 58 ℃、30 s; 72℃、30 s)；72 ℃，10 min；4 ℃保存，各成分用量按照說明書要求確定。PCR產(chǎn)物經(jīng)過2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳后用凝膠電泳回收試劑盒純化，純化產(chǎn)物與pMDTM18-T載體進(jìn)行連接，各成分用量按照說明書要求，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，將熱激活后的大腸桿菌涂至含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)18 h后挑取12個單菌落分別培養(yǎng)后進(jìn)行測序，檢驗(yàn)是否出現(xiàn)突變、突變效率及突變位點(diǎn)以確定獲得有活性的sgRNA。

1.2.6 可遺傳突變個體的篩選與培育

同批量注射的斑馬魚受精卵選定作為首建者在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖，性成熟后配對繁殖，受精卵發(fā)育至1 000細(xì)胞以上時制備基因組DNA模板，通過PCR檢測、凝膠電泳及測序，了解不同F(xiàn)0親魚所能產(chǎn)出F1代目標(biāo)基因的突變情況，檢測bco1基因引物為正向引物bco1-S1: 5′AGGCAAGTTAGGGTAATGAT3′，反向引物bco1-A1：5′TCAACTGCACCACAGAGTAA3′；檢測bco1l基因引物為正向引物bco1l-S1: 5′CTTGCCTCCCAGAATTGAC3′，反向引物bco1l-A1：5′CTGAGAACAGACCAGGACCATT3′。選取F1代經(jīng)PCR檢測后，進(jìn)行凝膠電泳時出現(xiàn)明顯雙條帶樣品，提示出現(xiàn)了較大片段的缺失或插入突變，便于后續(xù)對突變位點(diǎn)的檢測；通過測序比對，篩選缺失或插入堿基數(shù)非3倍數(shù)突變，在此基礎(chǔ)上選擇產(chǎn)出長片段有效突變的首建者魚，產(chǎn)卵獲得F1代群體。F1代培養(yǎng)至性成熟，通過檢測尾鰭的DNA篩選所需基因型的F1代魚，相同基因型的F1代魚自交得F2代，待F2代培養(yǎng)至50日齡，通過檢測尾鰭的DNA篩選出突變純合子。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 所得基因相關(guān)信息

由網(wǎng)頁http://asia.ensembl.org/查得bco1與bco1l基因序列信息，bco1基因信息見網(wǎng)頁(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Gene/Summary?db=core;g=ENSDARG00000104256;r=7:65037326-65066446)；bco1l基因信息見網(wǎng)頁(http://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Transcript/Summary?db=core;g=ENSDARG00000103659;r=7:65016199-65028910;t=ENSDART00000168287)(圖1)。

根據(jù)bco1中蛋白質(zhì)保守功能結(jié)構(gòu)域和共同區(qū)域蛋白質(zhì)序列，將敲除的目標(biāo)序列設(shè)計在3個轉(zhuǎn)錄本共同對應(yīng)的保守的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上，對應(yīng)于bco1-001轉(zhuǎn)錄本Exon 4和Exon 5(bco1-002：Exon 3和Exon 4; bco1-003：Exon 2和Exon 3)。其中，Exon 4檢測引物為正向引物bco1-4S:5′ATGTAGTTCTGGTCAGGTCA3′；反向引物bco1-4A:5′GTCACGTGGTCAAGTTGTCA 3′；Exon 5檢測引物為正向引物bco1-5S：5′AGGCAAGTTAGGGTAATGAT3′；反向引物bco1-5A：5′TCAACTGCACCACAGAGTAA3′(表1)。

根據(jù)bco1l基因序列信息，得知其Exon 2和Exon 3之間內(nèi)含子較短，而Exon 1和Exon 2之間內(nèi)含子太長，因此將敲除的目標(biāo)序列設(shè)計在Exon 2和Exon 3上，檢測引物為正向引物bco1L2-3S：5′CTTGCCTCCCAGAATTGAC3′；反向引物bco1L2-3A：5′TGTAGTTGACCTCCGATGA3′(表2)。

根據(jù)以上所獲得斑馬魚bco1與bco1l基因的相關(guān)信息，分析相關(guān)信息發(fā)現(xiàn)，bco1與bco1l基因均位于第7號染色體上，且屬于前后緊密連鎖關(guān)系。目前bco1基因已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，而缺乏關(guān)于bco1l基因的相關(guān)信息，此次試驗(yàn)將兩者分開單獨(dú)敲除，以便后續(xù)研究確定兩者功能與關(guān)系。

圖1 斑馬魚bco1與bco1l基因在基因組上的位置與結(jié)構(gòu)Fig. 1 Locations and genomic structures of bco1 gene and bco1l gene of zebrafish genome

表1 斑馬魚bco1基因Exon 4和Exon 5序列信息Table 1 Sequence information of Exon 4 and Exon 5 of bco1 gene of zebrafish

2.2 sgRNA的設(shè)計與有效性的檢測

對于bco1基因，此次位點(diǎn)選擇在所有轉(zhuǎn)錄本共有外顯子中的第二、三個外顯子上，選取表3中sgRNA進(jìn)行顯微注射，如圖2檢測到有效sgRNA為bco1-gRNA-4與bco1-gRNA-5，在12個單克隆測序結(jié)果中，sgRNA4位點(diǎn)突變樣本有10個，sgRNA5位點(diǎn)突變樣本有12個，兩位點(diǎn)共同突變樣本有10個，且2個sgRNA位點(diǎn)臨近，故選取這2個sgRNA進(jìn)行批量注射，獲得F0代。

對于bco1l基因，此次位點(diǎn)選擇在第二、三號外顯子上，選取表4中sgRNA進(jìn)行顯微注射，如圖2檢測到有效sgRNA為bco1l-gRNA-1與bco1l-gRNA-2，在12個單克隆測序結(jié)果中，此2個sgRNA位點(diǎn)突變樣本各有1個，并沒有兩位點(diǎn)共同突變的樣本，2個sgRNA位點(diǎn)有所重疊，故選取這2個gRNA進(jìn)行批量注射，獲得F0代。

此次實(shí)驗(yàn)成功設(shè)計并獲得有效的sgRNA，然而2個基因上的gRNA效率相差非常大：bco1基因上選取的2個sgRNA效率可高達(dá)100%，而bco1l基因僅有2個sgRNA檢測到有效，且效率最高也只達(dá)到8.33%(表5)。

表2 斑馬魚bco1l基因Exon 2和Exon 3的序列信息Table 2 Sequence information of Exon 2 and Exon 3 of bco1l gene of zebrafish

表3 根據(jù)bco1基因選取的sgRNA靶位點(diǎn)寡核苷酸序列Table 3 Selected sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1 gene

表4 根據(jù)bco1l基因選取的sgRNA靶位點(diǎn)寡核苷酸序列Table 4 Selected sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1l gene

表5 斑馬魚bco1與bco1l基因有效sgRNA靶位點(diǎn)寡核苷酸序列及其效率Table 5 Effective sgRNA target site oligonucleotide sequence of bco1 gene and bco1l gene and their efficiency

圖2 F1代bco1基因篩選過程及突變類型注： (A) F1代部分突變類型凝膠電泳圖，其中M，Marker；WT，Wild type；1#～7#為7種F1代突變個體，各組突變堿基數(shù)為1#，-41/0；2#，-31/0；3#，+37/0；4#，-16/+37；5#，-17/0；6#，+11/0；7#，-1/0。(B) 單克隆前后測序結(jié)果對比圖，其中(1)為4#號雙條帶樣本測序結(jié)果，在突變位點(diǎn)后出現(xiàn)雙峰；(2),(3)為該樣本通過單克隆后的測序結(jié)果，分別與野生型序列進(jìn)行對比得出圖(C)的結(jié)果。(C) F1代單克隆樣本測序結(jié)果對比所得突變基因型情況，下劃線部分為gRNA位點(diǎn)，藍(lán)色標(biāo)注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標(biāo)注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。Fig. 2 Screening process and genotypes identified in F1 generation of bco1 mutantsNote: (A) Gel electrophoresis map of part of genotypes found in F1 of bco1 mutants; M, Marker; WT, Wild type; 1#-7#, 7 types of bco1 mutants in F1 generation, number of mutated bases in each type as 1#, -41/0; 2#, -31/0; 3#, +37/0; 4#, -16/+37; 5#, -17/0; 6#, +11/0; 7#, -1/0. (B) Schematics of monocloning sequencing, (1) is the sequencing result of 4# in (A); (2),(3) are the sequencing results of monoclonal samples of 4# in (A), compared with the sequence of wild type, and then obtained (C); (C) NGG (blue) is the PAM (protospacer adjacent motif) sequence. Insertion is highlighted in red and deletion is represented by a dashed line.

圖3 斑馬魚bco1l基因檢測得到的部分突變類型注：下劃線部分為gRNA位點(diǎn)，藍(lán)色標(biāo)注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標(biāo)注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。Fig. 3 Part of genotypes found in bco1l mutantsNote: NGG (blue) is the PAM (protospacer adjacent motif) sequence. Insertion is highlighted in red and deletion is represented by a dashed line.

2.3 可遺傳突變個體的篩選和獲得

對于基因bco1，F(xiàn)1代篩選過程及檢測所得基因型如圖2，圖中下劃線部分為sgRNA識別位點(diǎn)，藍(lán)色標(biāo)注為前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)，紅色標(biāo)注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。由于該基因所用的2個sgRNA效率較高，而且鄰近，因此獲得較多雙條帶的樣本，挑選雙條帶差距較大的樣本進(jìn)行測序，確定突變位點(diǎn)，并通過單克隆樣本測序確定兩等位基因的突變情況(見圖3)。由于篩選出了插入37個堿基(+37)和缺失16個堿基(-16)的基因型(-16/+37)突變體，其基因型較為理想，因此以此突變體進(jìn)行建系，自交得出F2代。

對于基因bco1l，篩選過程同基因bco1，但由于此基因敲除所用sgRNA效率較低，因此得到雙條帶樣本極少，于F1代檢測所得基因型如圖3，圖中下劃線部分為gRNA位點(diǎn)，此處2個gRNA識別序列有4個堿基的重疊，藍(lán)色標(biāo)注為PAM結(jié)構(gòu)(NGG)，紅色標(biāo)注為插入堿基，虛線表示缺失堿基。選取插入14個堿基(+14)的基因型(+14/0)突變體進(jìn)行保種培養(yǎng)，自交得出F2代。

此次試驗(yàn)中，在選取F0代個體時，通過F0配對自交，制備受精卵基因組DNA模板進(jìn)行PCR和凝膠電泳驗(yàn)證，保留在凝膠電泳圖為雙條帶并且突變堿基數(shù)為非3倍數(shù)的親本產(chǎn)卵以培育F1代。F0代自交獲得純合子后代效率理論上比F0代與野生型雜交獲得純合子后代的效率高。但此次在F1代中并沒有獲得足夠的雙突變個體，僅發(fā)現(xiàn)有2條雙突變個體，但是突變類型完全不同，分別為(-16/+37)基因型和(-17/+11)基因型，因此無法配對留做后續(xù)使用。此外，在凝膠電泳圖要得到清晰穩(wěn)定的雙條帶，除了PCR產(chǎn)物大小要控制在100～300 bp外，對引物的特異性也有一定的要求，并不是能夠得出單一野生型條帶的引物就一定能夠獲得清晰穩(wěn)定的雙條帶，與所用的PCR試劑也有一定的關(guān)系，需要事先摸索條件加以確定。

斑馬魚bco1基因突變體F2代的基因型檢測中從260尾F2代中共獲得42尾缺失16堿基的突變型(-16/-16)基因型純合子個體，以供后續(xù)研究。并保留10余尾(-16/+37)基因型突變體作為保種培養(yǎng)；bco1l基因突變體F2代的基因型檢測中共檢測出91尾，其中雜合子65尾(+14/0)，野生型26尾(WT)，比例為雜合子：野生型=2.5:1，符合孟德爾遺傳定律，因此可以認(rèn)為bco1l基因突變純合致死。而此前曾以bco1l基因突變體F2代剛孵出的幼魚進(jìn)行基因型確認(rèn)時，檢測出突變純合基因型，比例符合純合子(5尾)：雜合子(10尾)：野生型(3尾)≈1:2:1，因此后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)需確認(rèn)純合子批量死亡具體時間，才能進(jìn)行bco1l基因功能的研究。

因此，通過對斑馬魚Ⅰ-細(xì)胞期受精卵進(jìn)行顯微注射Cas9 mRNA與特定的sgRNA，并以yfp-nanos3 mRNA作為顯微注射指示劑，可以有效地對目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，獲得所需的突變類型，并且獲得可穩(wěn)定遺傳個體。

致謝：該研究得到國家科技支撐計劃項(xiàng)目：魚類實(shí)驗(yàn)動物新資源的開發(fā)與標(biāo)準(zhǔn)化研究(2015BAI09B05)資助；感謝珠江水產(chǎn)研究所提供實(shí)驗(yàn)平臺及基礎(chǔ)設(shè)施。