閤靜，趙云，黃佳偉，張萍，潘雯，尤安琪，黃希，楊旭，李睿

華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

2016年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布報(bào)告指出，世界上92%的人口生活在空氣質(zhì)量水平超過世界衛(wèi)生組織限值的地區(qū)[1]。在我國(guó)，當(dāng)前最為關(guān)注的城市室外和室內(nèi)空氣污染物分別是PM2.5和甲醛[2-3]。

大氣PM2.5，指空氣動(dòng)力學(xué)等效直徑≤2.5 μm的細(xì)顆粒物，是我國(guó)近年來對(duì)人體健康影響最大的空氣污染物。吸附了不同污染物的PM2.5被吸入到肺組織后，可通過微血管擴(kuò)散到血液中，引起肺癌、呼吸道疾病、心血管疾病[4-5]，以及免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)疾病等健康問題[6-7]。謝元博等[8]發(fā)現(xiàn)，PM2.5每增加10 μg·m-3，北京市健康居民哮喘發(fā)病率增加2.10%。另外，2016年《環(huán)境衛(wèi)生展望》(EnvironmentalHealthPerspectives，EHP)雜志上的一文指出，PM2.5濃度增加量即使低至4.00～7.06 μg·m-3，都與健康人群哮喘的患病率上升相關(guān)[9]。上述研究表明，室外大氣PM2.5與哮喘發(fā)病率相關(guān)，其暴露可引起肺組織損傷。

甲醛作為一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于建筑、木材加工、家具、紡織品等產(chǎn)業(yè)。它對(duì)人體健康的負(fù)面影響涉及多個(gè)組織器官，主要表現(xiàn)為眼部和呼吸道的刺激作用，呼吸道紊亂、哮喘或類似哮喘的病癥，長(zhǎng)期接觸甲醛還可導(dǎo)致鼻腔、鼻咽、消化道和皮膚的癌變，以及白血病等造血系統(tǒng)惡性腫瘤[10]。岳偉等[11]在甲醛暴露和成人哮喘關(guān)系的病例對(duì)照研究中指出，甲醛濃度超過0.12 mg·m-3后，室內(nèi)甲醛每升高10 μg·m-3，健康成人哮喘危險(xiǎn)性提高0.2倍。澳大利亞Rumchev等[12]研究發(fā)現(xiàn)，甲醛暴露水平達(dá)到或超過0.60 mg·m-3時(shí)，健康兒童發(fā)生哮喘的危險(xiǎn)度就會(huì)增加。上述2項(xiàng)研究表明，甲醛暴露可以誘導(dǎo)健康成人和兒童發(fā)生哮喘，且兒童的對(duì)甲醛的敏感性更高。

目前，無論流行病學(xué)或是實(shí)驗(yàn)研究，都主要關(guān)注室外大氣PM2.5和甲醛的單獨(dú)暴露效應(yīng)，二者聯(lián)合暴露效應(yīng)在環(huán)境學(xué)界的研究迄今為止鮮有報(bào)道。2016年中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)數(shù)據(jù)顯示，2016年80%城市PM2.5濃度超過我國(guó)環(huán)保部的安全標(biāo)準(zhǔn)35 μg·m-3[3]。此外，目前我國(guó)城市室內(nèi)甲醛超標(biāo)居室比例高達(dá)70%[13]?；赑M2.5和甲醛超標(biāo)污染的客觀情況，二者復(fù)合暴露更接近于我國(guó)城市居民的真實(shí)生活環(huán)境。因此，研究二者聯(lián)合暴露的健康效應(yīng)非常必要。本項(xiàng)研究中，通過肺組織病理學(xué)觀察、氧化應(yīng)激、DNA損傷及細(xì)胞凋亡等生物學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)，從而探討PM2.5和甲醛單一及復(fù)合暴露誘導(dǎo)產(chǎn)生小鼠肺損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6周齡雄性Balb/c小鼠(約22 g)購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。購買回來后在動(dòng)物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)1周，待其適應(yīng)新環(huán)境后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)室的環(huán)境條件為：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，光暗循環(huán)周期為12 h:12 h。

1.2 主要試劑與儀器

福爾馬林(10%，Sigma公司)，PM2.5染毒液(采集于華中師范大學(xué))，AZD8055(Abmole Bioscience公司)，GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所)，小鼠8-OH-dG ELISA試劑盒(Blue Gene)，小鼠Caspase-3 ELISA試劑盒(Blue Gene)，蛋白酶K(Merck)，Hoechst 33258熒光染料(Sigma公司)，小型智能環(huán)境氣候倉(WH-2)，氣態(tài)甲醛濃度測(cè)定儀(4160-2)，全波長(zhǎng)/熒光酶標(biāo)儀(Bio-tek)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(DNM-9602)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 PM2.5樣品制備

2015年10月—2016年1月，在華中師范大學(xué)建筑物樓頂(高10 m左右，周圍沒有明顯的污染源)放置Thermo Anderson G-2.5大流量釆樣器(美國(guó)熱電子公司)，采用石英纖維濾膜(英國(guó)Whatman公司)采集大氣PM2.5。采樣后將采有PM2.5的濾膜裁剪為長(zhǎng)寬均為l cm，浸入去離子水中，超聲振蕩15 min，重復(fù)3次，洗脫P(yáng)M2.5，振蕩液用6層紗布過濾，濾液冷凍真空干燥(Labconco，USA)，低溫冰箱保存?zhèn)溆?。暴露時(shí)，用無菌生理鹽水配制成相應(yīng)濃度懸液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與暴露方案

實(shí)驗(yàn)采用48只SPF級(jí)雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為6組，每組8只小鼠。FA采用職業(yè)氣態(tài)暴露方式(3 mg·m-3，8 h·d-1，5 d·w-1，2 w)，PM2.5采用氣道滴注的暴露方式(2.5 mg·mL-1，40 μL·次-1，3次·w-1，2 w)。介導(dǎo)DNA損傷修復(fù)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)特異性的阻斷劑AZD8055采用灌胃的方式進(jìn)行暴露，暴露的劑量為20 mg·kg-1·d-1。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與暴露方案如圖1所示。

1.3.3 肺組織勻漿液制備

第12天染毒結(jié)束之后，將小鼠頸椎脫臼處死，取小鼠肺組織，稱重，加入一定量預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用玻璃勻漿器在0～4 ℃下制成10%的組織勻漿液，將勻漿液以10 000 r·min-1離心15 min，取上清備用。

1.3.4 生化指標(biāo)測(cè)定

小鼠肺蛋白含量測(cè)定：Folin-酚法測(cè)定小鼠肺組織勻漿的蛋白含量，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行。ROS含量測(cè)定：采用2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)法，取小鼠肺組織勻漿并用PBS稀釋100倍。每孔100 μL加入酶標(biāo)板中。加入10 mmol·L-1的DCFH-DA 100 μL，在37 ℃下避光保存10 min后，在480 nm激發(fā)光、520 nm 發(fā)射光下測(cè)量其熒光強(qiáng)度。GSH含量測(cè)定：具體實(shí)驗(yàn)步驟按照所使用試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行。MDA含量測(cè)定：采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)法。取10 mL試管，每管加入0.5 mL待測(cè)樣品液，然后各管加入2 mL 6%TBA溶液，混勻后沸水浴15 min，取出后流水冷卻。10 000 r·min-1離心10 min，取上清液分別在450 nm、532 nm和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，按C(μmol·L-1) = [6.45 (A532-A600) -0.56A450]/蛋白濃度，計(jì)算出每管樣品中MDA的濃度。DPC系數(shù)測(cè)定：采用KCl-SDS沉淀法。向樣品中加入100 mmol·L-1KCl可形成十二烷基硫酸鉀-蛋白質(zhì)沉淀聯(lián)合物，而游離的DNA留在上清液中。將上清轉(zhuǎn)移后，向沉淀加入蛋白酶K消化與DNA交聯(lián)的蛋白質(zhì)，使交聯(lián)的DNA釋放出來。再加入熒光染料Hoechst 33258對(duì)DNA染色，測(cè)定熒光值即可得出DNA的相對(duì)含量。最后通過公式來計(jì)算DPC系數(shù)，DPC=交聯(lián)DNA含量/(交聯(lián)DNA含量+游離DNA含量)。8-OH-dG和Caspase-3含量測(cè)定：使用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定,具體實(shí)驗(yàn)步驟按照所使用試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范進(jìn)行。

圖1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與暴露方案Fig. 1 Experimental groups and exposure scheme

1.3.5 小鼠肺組織切片

從氣管開始小心剝離完整的肺，之后在預(yù)冷的生理鹽水中沖洗干凈肺表面的血跡，做好標(biāo)記后浸沒于固定液中。48 h后，經(jīng)脫色、清洗、染色、脫水等處理后用石蠟包埋，切成約10 μm的薄片，制成永久裝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 5軟件作圖，SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，Turkey多重比較(multiple comparisons)檢驗(yàn)組間均值的差異顯著性，顯著水平α定為P<0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 小鼠一般體征和體重的變化

對(duì)照組小鼠皮毛干爽光滑，精神狀態(tài)良好，喜動(dòng)而不喜臥。染毒2周后，與對(duì)照組相比，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組小鼠的毛汗?jié)褙Q立，精神萎靡，喜擠臥而不喜動(dòng)。小鼠體重的變化如圖2所示，各染毒組小鼠的體重與對(duì)照組相比都出現(xiàn)不同程度的降低(P>0.05)。

圖2 小鼠體重變化Fig. 2 Body weight change in mice

2.2 小鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

染毒2周后，小鼠肺組織ROS含量變化如圖3A所示，與對(duì)照組相比PM2.5組、FA組、PM2.5+FA組以及PM2.5+FA+AZD8055組的ROS水平都顯著上升(P<0.001)；分別與PM2.5、FA單獨(dú)暴露組相比，PM2.5+FA組的ROS含量的增加也具有顯著差異(P<0.001)；與PM2.5+FA組相比，PM2.5+FA+AZD8055組的ROS含量顯著性增加(P<0.05)。小鼠肺組織GSH含量變化如圖3B所示，與對(duì)照組相比，各組GSH水平均表現(xiàn)為顯著性下降(P<0.01或P<0.001)；相比于PM2.5組，PM2.5+FA組中GSH含量顯著性降低(P<0.05)。小鼠肺組織MDA含量變化如圖3C所示，與對(duì)照組相比，PM2.5組的MDA水平顯著性上升(P<0.05)，F(xiàn)A組，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組MDA水平顯著性上升(P<0.01)；與PM2.5組相比，PM2.5+FA組MDA水平顯著性上升(P<0.05)；相比與PM2.5+FA組，PM2.5+FA+AZD8055組MDA水平顯著上升(P<0.05)。

2.3 小鼠肺組織DNA損傷測(cè)定結(jié)果

小鼠肺組織DPC含量變化如圖3D所示，與對(duì)照組相比，各組DPC水平均顯著性上升(P<0.01或P<0.001)。小鼠肺組織8-OH-dG含量變化如圖3E所示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)A組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.05)；PM2.5組，PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.01)；與PM2.5、FA單獨(dú)暴露組相比，PM2.5+FA組8-OH-dG含量顯著上升(P<0.01)。

2.4 小鼠肺組織凋亡Caspase-3含量測(cè)定結(jié)果

圖3F顯示，相比于對(duì)照組，各組Caspase-3含量顯著上升(P<0.001)。與PM2.5組、FA組單獨(dú)暴露組相比，PM2.5+FA組Caspase-3含量顯著性(P<0.05)上升。

2.5 肺組織H&E染色

肺組織H&E染色切片鏡檢結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組和AZD8055組小鼠的肺組織切片表現(xiàn)為氣道組織上皮結(jié)構(gòu)完整，氣道壁光滑，沒有明顯的細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道平滑肌細(xì)胞為單層排列。PM2.5組和FA組小鼠的肺組織切片表現(xiàn)為氣道壁增厚，氣道皺縮，周圍出現(xiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)。從PM2.5+FA組和PM2.5+FA+AZD8055組可以看出，氣道表皮出現(xiàn)了嚴(yán)重的皺縮、斷裂，氣管周圍與肺泡腔出現(xiàn)大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論(Discussion)

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，生理水平的ROS可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞增殖、遷移、分化和基因表達(dá)等生命過程。當(dāng)機(jī)體受到外界不良因素刺激時(shí)，過量生成的ROS可以耗竭體內(nèi)GSH，造成機(jī)體中生物大分子過氧化，其中MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一[14]。持續(xù)的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致包括Caspase-3在內(nèi)的凋亡因子釋放，使線粒體功能失調(diào)，產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[15]。本研究中，PM2.5復(fù)合甲醛暴露后，小鼠肺組織中ROS和MDA含量出現(xiàn)顯著性上升，GSH含量下降，表明PM2.5聯(lián)合甲醛暴露可以使機(jī)體抗氧化能力降低，導(dǎo)致肺組織產(chǎn)生氧化損傷。此外，二者單獨(dú)暴露均會(huì)導(dǎo)致肺組織中Caspase-3含量顯著升高，復(fù)合暴露可顯著提升小鼠肺組織Caspase-3水平。由此推測(cè)，PM2.5與甲醛共同作用導(dǎo)致小鼠肺組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激，從而誘導(dǎo)凋亡因子釋放和線粒體功能失調(diào)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。

圖3 小鼠肺組織氧化應(yīng)激、 DNA損傷、細(xì)胞凋亡測(cè)定結(jié)果注：與對(duì)照相比，* P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與PM2.5+FA組相比，#P<0.05，## P<0.01，### P<0.001。Fig. 3 The oxidative stress, DNA damage, apoptosis levels in the lung tissueNote: Compared with control group, * P<0.05, **P<0.01,***P<0.001; compared with PM2.5+FA group, # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001.

圖4 小鼠肺組織切片H&E染色注： A，對(duì)照組；B，AZD8055組；C，PM2.5組；D，F(xiàn)A組；E，PM2.5+FA組；F，PM2.5+FA+AZD8055組。黑色箭頭為支氣管重塑；藍(lán)色箭頭為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Fig. 4 Histopathological changes of mouse lung tissue stained with H&ENote: A, Control group; B, AZD8055 group; C, PM2.5 group; D, FA group; E, PM2.5+FA group; F, PM2.5+FA+AZD8055 group. Black arrows indicate bronchial remodeling；blue arrows indicate inflammatory cells infiltration.

此外，過量的ROS還能攻擊DNA分子，形成穩(wěn)定的共價(jià)化合物8-OH-dG嚴(yán)重影響DNA分子的構(gòu)象與功能，阻礙正常的基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄翻譯過程[16]。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)研究均表明，甲醛可以誘導(dǎo)大鼠肺組織DNA生成8-OH-dG，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)[17]，而Longhin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露會(huì)導(dǎo)致8-OH-dG含量的增加。本研究中，PM2.5聯(lián)合甲醛暴露后，小鼠肺組織8-OH-dG含量增加，由此說明，PM2.5和/或甲醛暴露能通過過量ROS從而引起小鼠產(chǎn)生DNA損傷。DPC是甲醛誘發(fā)DNA損傷的主要形式，由DNA和蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)形成。甲醛作為交聯(lián)劑直接導(dǎo)致與之接觸的組織和細(xì)胞形成過量DPC，影響了DNA的結(jié)構(gòu)和功能[19-20]。本研究中，PM2.5和甲醛單獨(dú)暴露均會(huì)導(dǎo)致肺組織DPC的形成，且PM2.5和甲醛復(fù)合暴露可顯著增加DPC的含量。由此推測(cè)，可能由于二者共同暴露導(dǎo)致肺組織發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量ROS，繼而介導(dǎo)了8-OH-dG和DPC形成，造成嚴(yán)重的DNA損傷效應(yīng)。

正常情況下，當(dāng)DNA損傷發(fā)生時(shí)，機(jī)體可啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)，其中，mTOR可通過mTORC1-S6K1激活范可尼貧血互補(bǔ)群基因D2(Fanconi anemia complementation group D2，F(xiàn)ANCD2)，進(jìn)而激活A(yù)TM-Chk2檢驗(yàn)點(diǎn)來修復(fù)DNA損傷，從而減少DNA分子損傷[22]。Guo等[22]的研究也表明，當(dāng)小鼠mTOR基因被敲除后，F(xiàn)ANCD2蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致了DNA的損傷，由此說明mTOR參與了DNA損傷的修復(fù)。AZD8055作為mTOR分子的特異性抑制劑，能夠特異性阻斷DNA的損傷修復(fù)，從而加重DNA的損傷[23]。本研究中，使用阻斷劑AZD8055后可使暴露于PM2.5和甲醛的小鼠體內(nèi)DPC和8-OH-dG含量顯著上升，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了AZD8055能夠阻斷mTOR介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)途徑，從而加重DNA的損傷。

綜上，本研究表明，PM2.5，甲醛暴露后小鼠肺組織發(fā)生病變，肺組織出現(xiàn)氧化損傷、DNA損傷和細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象，導(dǎo)致了小鼠的肺損傷。PM2.5和甲醛聯(lián)合暴露會(huì)加重小鼠肺損傷，表現(xiàn)為協(xié)同作用。而復(fù)合暴露導(dǎo)致肺部的氧化損傷，因破壞DNA損傷修復(fù)而加重的DNA損傷，以及細(xì)胞凋亡可能是聯(lián)合暴露導(dǎo)致肺損傷的重要機(jī)制。PM2.5和甲醛復(fù)合暴露肺損傷對(duì)解釋我國(guó)哮喘的發(fā)病率居高不下具有一定的提示作用。

致謝：感謝科技部十三五國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(No：2017YFC0702700)和國(guó)家自然科學(xué)基金(No: 21577045)對(duì)本研究的資助。