徐艷，崔玉曉，楊洋，羅義，鄭向群，毛大慶,*

1. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071 2. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，天津 300191 3. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 教育部環(huán)境污染過程與基準重點實驗室，天津 300071

目前環(huán)境中耐藥細菌及基因普遍傳播，引起細菌耐藥污染問題受高度重視，各界學(xué)者對環(huán)境中細菌耐藥的研究也日益增多。細菌耐藥主要由質(zhì)粒、整合子等可移動遺傳元件轉(zhuǎn)移獲得進而傳播擴散，且毒力或耐藥基因可能通過水平轉(zhuǎn)移到致病菌上，甚至?xí)鹦滦蛡魅静〉谋┌l(fā)和流行，由此產(chǎn)生的“超級”耐藥菌時刻威脅著人類健康。面對外源遺傳物質(zhì)(如噬菌體和質(zhì)粒)的侵入，細菌自身進行抵御形成一個針對這些外源遺傳物質(zhì)入侵的免疫系統(tǒng)，成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及相關(guān)基因(CRISPR-associated, Cas)組成的系統(tǒng)(CRISPR/Cas)具有一類獨特的結(jié)構(gòu)，大多分布于細菌和古細菌基因組中[1]。早期Moineau教授在Nature期刊上發(fā)文提到，一些細菌將攜帶抗性基因的核酸片段重組到基因組中，導(dǎo)致細菌喪失接受質(zhì)粒嵌入的特性，意味著細菌獲得了對耐藥基因的免疫能力，可以抵御細菌耐藥性?？傃灾?，CRISPR系統(tǒng)建立了一套特異性的防御體系，能夠有效防御外源遺傳物質(zhì)的侵入，確保本身遺傳信息的完整性。

當(dāng)前針對CRISPR/Cas系統(tǒng)如何防御細菌耐藥的研究尚少，Marraffini等[2-3]發(fā)現(xiàn)通過靶向DNA CRISPR系統(tǒng)干擾某特定葡萄球菌耐藥基因水平轉(zhuǎn)移，限制耐藥致病菌的傳播擴散，但其機制尚不清楚，現(xiàn)CRISPR/Cas進化對水平基因轉(zhuǎn)移有抑制作用的直接證據(jù)尚且缺乏[4]。值得關(guān)注的是研究發(fā)現(xiàn)為了在環(huán)境壓力影響下生存的一些缺少CRISPR系統(tǒng)的菌株更容易獲得耐藥基因，并且缺少CRISPR系統(tǒng)會導(dǎo)致細菌更容易受到噬菌體的攻擊，這一矛盾體現(xiàn)在不同種類的細菌中CRISPR系統(tǒng)與細菌耐藥性的關(guān)系千差萬別。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)簡介及作用機制

CRISPR/Cas系統(tǒng)大致由CRISPR、前導(dǎo)序列以及Cas蛋白三部分共同構(gòu)成(圖1)。CRISPR由多個重復(fù)序列(Repeat)和間隔序列(Spacer)組成。其中前導(dǎo)序列與重復(fù)序列相連，可以識別新的間隔序列，啟動前-crRNA(CRISPR RNAs)的轉(zhuǎn)錄。Cas基因家族具有多種基因亞型，位于CRISPR位點附近，用于編碼CRISPR的相關(guān)蛋白質(zhì)，且通過tracrRNA(trans-activating crRNA)將crRNA前體修飾為成熟的crRNA并與crRNA協(xié)同作用，共同構(gòu)筑細菌的免疫屏障。CRISPR的間隔序列在相同或者不同菌種間都會存在差異，并且多樣性較高[5-6]。

Cas基因作為CRISPR相關(guān)蛋白基因，一般來說每種CRISPR/Cas系統(tǒng)包含4～10個cas基因，串聯(lián)排列成cas基因簇[7]。由于不同的獲取形式、來源等使間隔序列具有多態(tài)性，CRISPR/Cas系統(tǒng)由多個Cas蛋白串聯(lián)構(gòu)成的復(fù)合體來產(chǎn)生免疫性。由于Cas基因數(shù)量和序列的不同，Cas蛋白具有多種差異類型。CRISPR/Cas一般分為3個類型：系統(tǒng)I、II及III[8-10]。截止2016年的統(tǒng)計，在古細菌和細菌中發(fā)現(xiàn)8 939種不同的CRISPR系統(tǒng)，約45.1%的細菌內(nèi)含有CRISRP系統(tǒng)(表1)。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為抵御外界的免疫系統(tǒng)，可從侵入的外源遺傳物質(zhì)中插入新的間隔序列，當(dāng)同一外源基因再次入侵時，會靶向裂解外源基因，從而抵抗噬菌體感染、限制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移等，為細菌提供特異性的免疫屏障[11-13]。

圖1 CRISPR/Cas的組成結(jié)構(gòu)Fig. 1 The composition structure of CRISPR/Cas

表1 CRISPR系統(tǒng)在微生物中的分布Table 1 Distribution of CRISPR system in microorganisms

CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)作用機制分三步(圖2)：(1)適應(yīng)階段，主要獲取CRISPR間隔序列。CRISPR系統(tǒng)會在前導(dǎo)序列與第一段重復(fù)序列之間插入一段與外源性基因片段(原間隔序列protospacer)同源的短DNA片段，每一次插入都會伴隨重復(fù)序列的復(fù)制，形成新的重復(fù)間隔單元[14-15]。(2)表達階段，主要是crRNA前體的轉(zhuǎn)錄與crDNA的加工階段。CRISPR將會被轉(zhuǎn)錄成一段長鏈的CRISPR RNA(crRNA)前體(pre-)，并且這一前體在重復(fù)序列處將會被剪切，隨后被Cas內(nèi)切酶加工成小crRNA。與Cas蛋白結(jié)合形成Cas/crRNA作用復(fù)合體[16]。(3)干擾階段，最后階段靶向定位與裂解外源性基因。crRNA作為Cas/crRNA作用復(fù)合體的導(dǎo)向，配合尋找同源的外源DNA靶標，如果crRNA與前間區(qū)序列完成互補配對，靶標將被作用的復(fù)合體降解。

圖2 CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的作用機制Fig. 2 The mechanism of CRISPR/Cas immune system

基因組編輯技術(shù)用于編輯已知的DNA序列，通過增加、刪除基因來實現(xiàn)基因功能的激活或者抑制，其中CRISPR/Cas技術(shù)是繼鋅指核酸酶(ZFN)、ES細胞打靶和TALEN等技術(shù)后用于定點構(gòu)建基因敲除的最新基因編輯技術(shù)方法，且有效率高、速度快及定位精確的特點，目前該技術(shù)成功應(yīng)用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確修飾。在醫(yī)療方面主要以CRISPR/Cas9作為“基因剪刀”用于基因編輯。目前有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CRISPR系統(tǒng)能夠限制質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移從而抑制耐藥的產(chǎn)生及傳播擴散。然而對于CRISPR系統(tǒng)與細菌耐藥及毒力的調(diào)節(jié)機制方面的研究尚少，且研究結(jié)論也不盡相同。

2 CRISPR/Cas與細菌耐藥的關(guān)聯(lián)

目前，CRISPR系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用在細菌、斑馬魚、鼠和人等基因組的修飾編輯中，尤其對CRISPR/Cas與耐藥的關(guān)系的研究逐漸深入。近幾年來，抗生素的殘留作為環(huán)境壓力影響環(huán)境中耐藥基因的產(chǎn)生、傳播與擴散，微生物為了利于生存通過水平轉(zhuǎn)移等方式獲得耐藥性，從而增加細菌的生存優(yōu)勢，這些耐壓基因在環(huán)境菌群中的進一步傳播對公眾健康造成了嚴重的威脅，并且研究發(fā)現(xiàn)這些環(huán)境中大多數(shù)耐藥細菌缺少CRISPR/Cas系統(tǒng)。少數(shù)耐藥菌株含有CRISPR/Cas系統(tǒng)，這可能是由于間隔序列相應(yīng)靶序列即原間隔序列發(fā)生突變，或者基因重組導(dǎo)致間隔序列丟失，導(dǎo)致CRISPR/Cas系統(tǒng)失效，該失效的系統(tǒng)與耐藥基因得以共存。研究推測在抗生素選擇長期壓力下，細菌為了平衡適合度代價，細菌優(yōu)先獲得耐藥基因，保證其生存。然而無外界環(huán)境壓力或壓力較低時，CRISPR/Cas系統(tǒng)可抵抗外源基因的侵入進行免疫防御，保證細菌自身遺傳物質(zhì)的完整及穩(wěn)定性。

目前，研究人員把靶向特定耐藥基因(例如編碼抗β-內(nèi)酰胺類抗生素的NDM-1、SHV-18基因)序列的gRNA，通過構(gòu)建的2種載體(如攜帶CRISPR元件的基因工程菌或注入CRISPR基因的噬菌體顆粒)將其導(dǎo)入細菌中，對含有的耐藥性和致病性的基因進行定位剪切，使其失活，進而使攜帶有害基因的細菌死亡。Bikard等[17]構(gòu)建了以受體菌上一段耐藥基因為靶標的CRIPSR元件，將攜帶此元件的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌后導(dǎo)致了細菌的死亡。近期，有學(xué)者通過利用CRISPR系統(tǒng)的免疫抵御機制，能夠特異性地去除幾乎所有攜帶NDM-1的細菌，并且成功地靶向了另一種編碼SHV-18的抗性基因和腸道出血性大腸桿菌中的一個毒力因子[18]。此外，基于遺傳標記技術(shù)，有研究已經(jīng)證實利用CRISPR系統(tǒng)可以從混合菌群中特異性去除某種細菌，由此為“微生物組編輯”的應(yīng)用開辟了一種新思路和方法。Alex等[19]對銅綠假單胞菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)育分布的研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)能夠獲取耐藥基因，在重塑輔助基因組分布方面具有重要作用。我國學(xué)者薛澤潤[20]對志賀菌中CRISPR的分布及結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)在志賀菌中是普遍存在的；不同時間分離出的志賀菌中CRISPR位點間隔序列分布存在一定差異，且發(fā)現(xiàn)Cas2基因的這種差異與志賀菌的耐藥程度具有一定相關(guān)性。王琳琳等[21]對志賀菌CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，多重耐藥的志賀菌中，CRISPR系統(tǒng)中的間隔序列數(shù)目均較少，且CRISPR/Cas系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)多種插入序列，同時發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列數(shù)目較少而相應(yīng)攜帶耐藥基因的數(shù)量卻較多，經(jīng)過接合轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)細菌耐藥后，相關(guān)的Cas基因堿基發(fā)生突變，充分證明志賀菌的耐藥性與CRISPR系統(tǒng)中重復(fù)序列的變異和間隔序列的多樣性有關(guān)。此外，蔡銀強等[22]對沙門菌中的CRISPR系統(tǒng)與耐藥性的研究發(fā)現(xiàn)，該菌種存在2個穩(wěn)定的CRISPR位點，沙門菌利用它們能夠抵御外源遺傳物質(zhì)的入侵，同時還可介導(dǎo)本身表型改變及基因亞類的進化。Zhang等[23]經(jīng)無抗生素壓力傳代90次后，多數(shù)志賀菌CRISPR3位點的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，CRISPR3位點與cas基因可能存在共進化，其中部分志賀菌對抗生素的敏感表型有不同程度的增加。近期Kang等[24]利用基因編輯手段將基于聚合衍生化的CRISPR納米復(fù)合物用于靶向細菌病原體和抗生素抗性，取得了一定效果。Müller等[25]利用CRISPR/Cas9與DNA圖譜結(jié)合的手段鑒定單質(zhì)粒上的抗生素抗性基因。綜上所述，CRISPR系統(tǒng)與細菌耐藥間存在直接關(guān)系，為以后防止細菌耐藥提供了重要參考。

2.1 CRISPR/Cas對耐藥轉(zhuǎn)移傳播的影響

細菌耐藥以水平轉(zhuǎn)移方式為主的基因相互傳遞，導(dǎo)致細菌耐藥性的傳播擴散[26-27]。之前有研究對強毒的MRSA USA300菌株進行測序分析，發(fā)現(xiàn)細菌CRISPR位點中的間隔序列是由基因的水平轉(zhuǎn)移獲得的，外源遺傳物質(zhì)如質(zhì)粒DNA的基因序列整合到CRISPR位點，重新獲得新的間隔序列從而產(chǎn)生耐藥性。此外，Palmer和Gilmore[28]對多重耐藥的腸球菌的CRISPR系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，多耐藥腸球菌均缺乏CRISPR/Cas系統(tǒng)元件，暗示細菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)可能對阻礙耐藥傳遞具有重要作用。另外對非致病的表皮葡萄球菌的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)菌株缺乏CRISPR序列，而從臨床環(huán)境分離的RP62a表皮葡萄球菌株含有CRISPR序列，可在一定程度上抵御外源性基因的入侵[29]。進一步研究間隔序列是否能阻止質(zhì)粒向RP62a表皮葡萄球菌轉(zhuǎn)移，Marraffini等[2]研究者將金黃色葡萄球菌中攜帶β-內(nèi)酰胺質(zhì)粒pG0400的相關(guān)核苷酸內(nèi)切酶位點基因沉默，產(chǎn)生突變型pG0，之后將野生型及突變型pG0均轉(zhuǎn)入2種表皮葡萄球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)到?jīng)]有CRISPR結(jié)構(gòu)的菌株中的這2種質(zhì)粒的接合效率相近，這說明CRISPR系統(tǒng)可以限制從金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移至表皮葡萄球菌的抗性質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移，該影響機制由靶DNA直接介導(dǎo)，其特異性取決于間隔序列與質(zhì)粒序列的一致性，表明細菌中CRISPR序列可通過阻礙水平轉(zhuǎn)移來抵御細菌耐藥性的傳播擴散。這種平衡發(fā)生于CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫抵御機制與耐藥基因水平轉(zhuǎn)移之間，基于CRISPR系統(tǒng)主要抑制基因在細菌間轉(zhuǎn)移的功能，CRISPR系統(tǒng)可以更清楚了解細菌耐藥譜型，明確細菌基因的水平轉(zhuǎn)移情況，通過對其結(jié)構(gòu)的修飾了解限制耐藥菌株傳播的分子響應(yīng)，為有效防控耐藥細菌的傳播擴散提供新的思路。

2.2 CRISPR/Cas對致病性毒力基因的控制

CRISPR系統(tǒng)在免疫防御過程中遇到外源性基因產(chǎn)生新間隔序列可能導(dǎo)致細菌毒力的改變。其中細菌獲得毒力和產(chǎn)生致病性一般主要通過噬菌體感染引起，如具有致病性的菌株霍亂弧菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌等均含有編碼毒力因子的溫和噬菌體基因，同時發(fā)現(xiàn)這些細菌的CRISPR間隔序列與噬菌體序列之間產(chǎn)生相互排斥，表明細菌中的CRISPR免疫系統(tǒng)可以通過抵御具有毒性的噬菌體入侵，干擾毒力因子在細菌間傳播。最近，Yang等[30]對32株金黃色葡萄球菌中確定的CRISPR位點分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR/Cas系統(tǒng)可限制細菌毒力因素的傳播擴散。之前有研究構(gòu)建了靶標為莢膜基因的肺炎鏈球菌CRISPR系統(tǒng)的感染模型，莢膜基因是肺炎鏈球菌的毒力基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRISPR系統(tǒng)防御干擾有效抑制了攜帶莢膜基因的質(zhì)粒進入無毒菌株，從而避免攜帶有毒力基因的菌株向無毒菌株的水平轉(zhuǎn)移，抑制了毒力株的產(chǎn)生[17]。而Nozawa等[31]對鏈球菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)的分析發(fā)現(xiàn)，CRISPR通過使噬菌體介導(dǎo)的毒力基因的轉(zhuǎn)入，導(dǎo)致了這些菌株產(chǎn)生致病性，進一步對13株化膿性鏈球菌基因組測序，發(fā)現(xiàn)部分菌株CRISPR/Cas系統(tǒng)中缺失cas基因，部分CRISPR位點的間隔序列與其他研究菌株間存在差異，暗示了噬菌體基因的高感染率可能與CRISPR/Cas系統(tǒng)的特異性有關(guān)。Yosef等[32]研究空腸彎曲菌強毒株的CRISPR系統(tǒng)，分析發(fā)現(xiàn)其CRISPR序列較短或完全缺失與細菌毒力增強息息相關(guān)，可導(dǎo)致嚴重腸道炎和感染后嚴重的并發(fā)癥。同樣，對腸球菌CRISPR結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)cas1基因的缺失會導(dǎo)致致病島的增多[32]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)可以降低細菌的毒力，其主要利用反義RNA作用影響免疫原性膜蛋白的表達，只是該毒力調(diào)節(jié)作用所需的RNA分子在不同細菌間千差萬別[33]。

通過對多種致病菌CRISPR序列及毒力編碼基因的大量研究發(fā)現(xiàn)，Cas9基因是CRISPR/CAS系統(tǒng)中細菌毒力調(diào)控的關(guān)鍵因子[8,34]。鑒于之前的研究啟示，原理上如果生產(chǎn)一種CRISPR元件以毒力或抗性基因作為靶標的基因藥物，它不僅能殺滅攜帶靶標的耐藥菌株或者致病菌，還能防止耐藥或毒力基因的傳播擴散，從而預(yù)防致病菌的大規(guī)模感染，同時也能治療被致病菌感染的人群?；诩僭O(shè)，研究者們構(gòu)建了2種不同的載體保證CRISPR元件進到細菌中，即基因工程菌質(zhì)粒上攜帶著CRISPR基因，以及噬菌體顆粒結(jié)合細菌并具有CRISPR基因，研究成功將攜帶CRISPR基因的這2種載體轉(zhuǎn)移到耐藥菌群中，并隨后將CRISPR元件轉(zhuǎn)移到一種受感染的大蠟螟(waxworm)幼蟲體內(nèi)，結(jié)果促進了幼蟲的生存。目前研究人員正在將此方法用于小鼠測試，預(yù)想這一方法可治療感染或是有針對性地除去患者體內(nèi)有害的細菌[18]。目前這種設(shè)想還存在著諸多需要解決的問題，但如果設(shè)計成功，那么這種藥物所具有的高度特異性可完全替代其他抗菌劑[35]。

目前研究發(fā)現(xiàn)通過利用CRISPR/Cas9在細胞DNA中的突變抑制病毒復(fù)制，仍會有些突變會促進病毒產(chǎn)生耐藥性，因此CRISPR/Cas9抗病毒療法靶向多個病毒DNA區(qū)域顯得非常重要。Wang等[36]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過靶向療法殺滅許多病毒時，總會有一些病毒逃脫CRISPR/Cas9的殺滅作用產(chǎn)生耐性，對逃脫的病毒RNA進行測序，意外發(fā)現(xiàn)大部分的病毒突變都位于Cas9促進DNA斷裂的位點附近，導(dǎo)致cas9無法進行序列的識別，因此面對這些耐藥性病毒的持續(xù)復(fù)制，CRISPR/Cas9技術(shù)用于抵御病毒的感染，仍需克服一些限制，如利用CRISPR/Cas9或除Cas9以外的其他酶類來靶向作用多個位點。另外，有研究表明CRISPR/Cas系統(tǒng)可以專門針對和切割保守區(qū)域的乙肝病毒基因組，從而導(dǎo)致病毒基因表達和復(fù)制的魯棒抑制[37]。Van Diemen等[38]研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9編輯能夠高效地破壞人巨細胞病毒HCMV復(fù)制，并且研究組設(shè)計出多種gRNA能夠降低導(dǎo)致唇皰疹和皰疹性角膜炎的1型單純皰疹病毒(HSV-1)的復(fù)制，當(dāng)將其中的2種gRNA組合使用，同時靶向2種必需基因時，能夠完全抑制HSV-1復(fù)制?；谀壳暗难芯砍晒?，CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于人類疾病的治愈指日可待。

2.3 CRISPR/Cas對細菌生物膜的影響

無論是工業(yè)、臨床還是生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中，細菌生物膜作為細菌的主要生長型，常常導(dǎo)致一些頑固的細菌感染。其中細菌群體感應(yīng)是生物膜表型的主要表達方式。狹小的細胞間隙，為基因在細菌間的水平轉(zhuǎn)移提供了理想的環(huán)境。一般自然條件下，微生物有2種生長狀態(tài)：浮游和生物膜，細菌形成生物膜，細菌群體感應(yīng)會提高抗生素的耐受性[39]。研究表明抗生素的外界壓力下細菌易形成生物膜，增加胞外多糖的含量，同時影響穩(wěn)定細菌生物膜的三維結(jié)構(gòu)[40]。Zegans等[41]發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)CRISPR系統(tǒng)的存在對生物膜形成具有抑制作用，同時降低了細菌群聚運動能力，且cas基因的亞類，如cas1可編碼整合酶，可能參與新噬菌體DNA序列入侵細菌CRISPR系統(tǒng)的過程，因此影響了細菌生物膜的形成及群聚運動等生理反應(yīng)。CRISPR介導(dǎo)的細菌生物膜的形成和群聚運動能力是限制噬菌體在細菌間傳播的重要機制，即被噬菌體感染的細菌將自己從生物膜及其他群體行為中隔離，這在防預(yù)細菌致病性大范圍感染方面起重要作用。Palmer等[42]的研究表明，銅綠假單胞菌生物膜的形成與CRISPR特異性插入序列有關(guān)，CRISPR/Cas系統(tǒng)的存在抑制了細菌生物膜的形成，推測該特異性插入序列轉(zhuǎn)錄形成反義RNA，從而導(dǎo)致其生物膜的形成受到抑制，這說明CRISPR/Cas系統(tǒng)可調(diào)節(jié)細菌生物膜形成。

另外，細菌被巨噬細胞吞噬后，吞噬體中的多種抗菌物質(zhì)及固有免疫反應(yīng)對其均具有殺傷作用，而該菌株CRISPR/Cas系統(tǒng)中的cas9、tracrRNA等作為調(diào)節(jié)因子，使其逃避宿主的抗菌作用。之前研究人上皮細胞模型發(fā)現(xiàn)cas9基因在腦膜炎奈瑟菌吸附于宿主細胞表面并侵入宿主細胞的過程中承擔(dān)重要角色[43]。另外，cas9基因的存在對空腸彎曲菌吸附入侵宿主結(jié)腸上皮細胞也同樣關(guān)鍵，表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在細菌感染宿主過程中發(fā)揮重要作用。

3 展望

CRISPR/Cas系統(tǒng)更新了對細菌功能調(diào)節(jié)的認識，為防治細菌耐藥的提供了新的方向，為醫(yī)療行業(yè)有效免疫治療提供手段。目前針對CRISPR系統(tǒng)的應(yīng)用正如火如荼地進行中：間隔序列顯現(xiàn)了細菌與噬菌體等外源DNA的相互過程，根據(jù)CRISPR位點中間隔序列的組成和排列順序，可以用來對細菌分型。CRISPR位點間隔序列的多態(tài)性反映出細菌的進化歷程，可用于研究不同細菌之間的親緣關(guān)系。目前已有研究者利用這一特性對炭疽芽胞桿菌、一些芽胞桿菌等進行分型與鑒別[44]；CRISPR/Cas9作為“基因剪刀”是目前一種熱點的基因組定點編輯技術(shù)，該技術(shù)成功應(yīng)用于微生物、斑馬魚和小鼠等動物以及人類細胞的基因組的精確修飾；利用CRISPR系統(tǒng)的免疫干擾功能抵御噬菌體，目前已將其利用到抵御噬菌體對嗜熱鏈球菌的破壞。在近期的一項重大研究上已使用CRISPR/Cas9工具剪切掉CD163基因中與豬藍耳病病毒感染有關(guān)的小部分片段，培育出多頭轉(zhuǎn)基因豬。對這些豬細胞的檢測發(fā)現(xiàn)，其對2種能引起豬繁殖與呼吸綜合病癥的子病毒具有完全抵抗力，從而能阻止感染和傳播[45]。利用CRISPR/Cas系統(tǒng)控制耐藥基因在細菌水平轉(zhuǎn)移、細菌基因組編程應(yīng)用、細菌的新表型獲得，為以后分子生物領(lǐng)域研究提供重要的基因工具。CRISPR系統(tǒng)越來越受關(guān)注成為廣大學(xué)者的研究對象，并且CRISPR系統(tǒng)研究已取得了顯著成果，利用CRISPR技術(shù)對病原微生物的改造，對病毒感染的抑制，對人類感染性疾病的防治有重大意義，未來CRISPR系統(tǒng)會在人類健康和醫(yī)學(xué)發(fā)展方面將給我們更多驚喜。